[發明專利]一種牛凍精X、Y精子分離方法

在審

• 申請號: 201810729487.5
• 申請日: 2018-07-05
• 公開（公告）號: CN108865982A
• 公開（公告）日: 2018-11-23
• 發明（設計）人: 生衛東;徐美芳;賀亞南;陳志南;張志鵬;田全召
• 申請（專利權）人: 河南省鼎元種牛育種有限公司
• 主分類號: C12N5/076
• 分類號: C12N5/076;A01N1/02
• 代理公司: 鄭州華智星知識產權代理事務所(普通合伙) 41145
• 代理人: 劉迪

本發明屬于牛凍精生產技術領域，具體涉及一種牛凍精X、Y精子分離方法，包括配置Staining液和稀釋液，Staining液中各成分及其終濃度為：Hepes：9.520g/L，MgCl₂·6H₂O：0.08g/L，NaCl：5.518g/L，KCl：0.224g/L，Na₂HPO₄：0.04g/L，NaHCO₃：0.84g/L，Napy：0.22g/L，葡萄糖：0.90g/L，Nalatctate：3.61ml/L，BSA：3.0g/L，慶大霉素：2.5ml/L；將牛冷凍凍精解凍，解凍后離心，棄上清液，計算沉淀精子數量；用Staining液將沉淀精子稀釋至濃度為1×10⁸個精子/ml，然后加入熒光染料，混合均勻后置于水浴中靜置，水浴后用流式細胞儀使X、Y精子分離，將X或Y精子置于冰箱中平衡，平衡后離心，棄上清液，收集沉淀X或Y精子，向X或Y精子中加稀釋液后冷凍保存。該方法分離效率高，性別控制準確率可達92％以上。

技術領域

本發明屬于牛凍精生產技術領域，具體涉及一種牛凍精X、Y精子分離方 法。

背景技術

在牛的養殖生產中，有選擇地繁殖出具有預知性別的牛后代將能大大提高 牛生產的速度和效率，用X或Y精子給母牛授精，在受精之前便可決定后代的 性別，從而顯著地改變后代的性別比例，達到性別控制的目的。目前，只有流 式細胞儀精子分離法被公認為最科學最可靠，同時也是最高效的精子分離方 法。流式細胞儀分離哺乳動物X、Y精子是根據哺乳動物X精子的DNA含量比Y 精子多的原理，熒光染色之后通過分辨熒光差別將二者分開，受精之后達到性 別控制的目的。

但是目前針對X、Y精子采用流式細胞儀所采用的分離手段如CN1667118A 中所述“在采集的公畜原精液中加入抗生素混合溶液，24小時內恒溫保存，用 不含卵黃的精子稀釋液將原精液稀釋后加入熒光染色劑、并在水浴鍋中孵育染 色，水浴結束后加入色素，在恒溫下利用流式細胞儀分離所需的X或Y精子， 用預裝有含卵黃的精子接受液的試管收集分離后的X精子和Y精子，分離得到 的精液經離心濃縮后可直接用于人工授精或體外授精，或低溫平衡后冷凍保 存?！痹摲N方法所采用的原精液為鮮精，且要求鮮精密度在8億精子/ml以上 且活力≥0.6，如果需要引進國外的所需的X或Y精子，需要引進活體?；蛘?引進胚胎或者是引進性控胚胎，此種方法所需費用較高，無法滿足國內市場的 需求。

發明內容

針對上述現有技術存在的不足之處，本發明的目的就在于提供一種操作簡 單、費用低且可適用于凍精性控分離X、Y精子的方法。

本發明通過以下技術方案來實現上述目的：

一種牛凍精X、Y精子分離方法，包括如下步驟：

步驟(1)配置Staining液和稀釋液

1.1)Staining液

Staining液中各成分及其終濃度為：Hepes：9.520g/L，MgCl₂·6H₂O：0.08g/L，NaCl：5.518g/L，KCl：0.224g/L，Na₂HPO₄：0.04g/L，NaHCO₃：0.84g/L，Napy： 0.22g/L，葡萄糖：0.90g/L，Nalatctate：3.61ml/L，BSA：3.0g/L，慶大霉素： 2.5ml/L；

1.2)稀釋液

稀釋液包括796份工作液、204份蛋黃，以及終濃度為0.007467ml/ml慶 大霉素、終濃度為0.005633ml/ml的抗生素泰勒菌素和林肯霉素，所述的工作 液中各成分及其終濃度為：Tris 30.44g/L，檸檬酸17.21g/L，果糖12.65g/L；

步驟(2)將牛冷凍凍精解凍，解凍后離心，棄上清液，計算沉淀精子數 量；