[發(fā)明專利]一種牛凍精X、Y精子分離方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810729487.5
• 申請日: 2018-07-05
• 公開（公告）號: CN108865982A
• 公開（公告）日: 2018-11-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 生衛(wèi)東;徐美芳;賀亞南;陳志南;張志鵬;田全召
• 申請（專利權(quán)）人: 河南省鼎元種牛育種有限公司
• 主分類號: C12N5/076
• 分類號: C12N5/076;A01N1/02
• 代理公司: 鄭州華智星知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 41145
• 代理人: 劉迪

1.一種牛凍精X、Y精子分離方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟(1)配置Staining液和稀釋液

1.1)Staining液

Staining液中各成分及其終濃度為：Hepes：9.520g/L，MgCl₂·6H₂O：0.08g/L，NaCl：5.518g/L，KCl：0.224g/L，Na₂HPO₄：0.04g/L，NaHCO₃：0.84g/L，Napy：0.22g/L，葡萄糖：0.90g/L，Nalatctate：3.61ml/L，BSA：3.0g/L，慶大霉素：2.5ml/L；

1.2)稀釋液

稀釋液包括796份工作液、204份蛋黃，以及終濃度為0.007467ml/ml慶大霉素、終濃度為0.005633ml/ml的抗生素泰勒菌素和林肯霉素，所述的工作液中各成分及其終濃度為：Tris 30.44g/L，檸檬酸17.21g/L，果糖12.65g/L；

步驟(2)將牛冷凍凍精解凍，解凍后離心，棄上清液，計算沉淀精子數(shù)量；

步驟(3)用Staining液將步驟(2)所得的沉淀精子稀釋至濃度為1×10⁸個精子/ml，然后加入熒光染料，混合均勻后置于水浴中靜置，水浴后用流式細(xì)胞儀使X、Y精子分離，將X或Y精子置于冰箱中平衡，平衡后離心，棄上清液，收集沉淀X或Y精子，向X或Y精子中加稀釋液后冷凍保存。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛凍精X、Y精子分離方法，其特征在于，步驟1.1)中Staining液的配置方法為：

將700-800ml的超純水倒入燒杯中，攪拌，分別依次加入Hepes、MgCl₂·6H₂O、NaCl、KCl、Na₂HPO₄、NaHCO₃、Napy、葡萄糖、Nalatctate和BSA搖勻后，采用NaOH溶液調(diào)節(jié)PH值至7.4，將燒杯中的溶液轉(zhuǎn)移至容量瓶，添加超純水定容至1000ml，封膜搖勻；將容量瓶中的液體靜置24h后過濾，濾液置于試劑瓶中，待用；

在使用前向試劑瓶中加入終濃度為2.5ml/L的慶大霉素。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛凍精X、Y精子分離方法，其特征在于，步驟1.2)中，配置稀釋液包括如下步驟：

(1)配置工作液

工作液的配置方法為在燒杯中加入700-800ml超純水，攪拌，并依次加入Tris、檸檬酸和果糖，溶解后采用NaOH溶液調(diào)節(jié)PH至6.80，將燒杯中的溶液轉(zhuǎn)移至容量瓶，添加超純水定容至1000ml，混合均勻后過濾，棄濾渣，將濾液在4℃條件保存?zhèn)溆茫?/p>

(2)配置稀釋液

稱取796ml工作液置于1000ml容量瓶中，并向容量瓶中加入204ml蛋黃，搖勻后放置24小時，將容量瓶中溶液離心過濾三次，然后按終濃度為0.005633ml/ml分別加入抗生素成品泰勒菌素和林肯霉素，終濃度為0.007467ml/ml加入慶大霉素，混合均勻，即制得稀釋液。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛凍精X、Y精子分離方法，其特征在于，步驟(2)中，所述的牛冷凍凍精為活力大于或等于0.35的液氮保存下的冷凍凍精。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛凍精X、Y精子分離方法，其特征在于，步驟(2)中，所述的解凍條件為將牛冷凍凍精置于38℃的水浴中解凍10s。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛冷凍X、Y精子分離方法，其特征在于，步驟(2)中，所述的離心操作為將牛冷凍凍精解凍后剪掉盛裝牛冷凍凍精的細(xì)管的非棉塞端，用推針從棉塞端將解凍后的凍精精液推至離心管中，在18℃、850G條件下離心10分鐘，離心后棄上清液。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛冷凍X、Y精子分離方法，其特征在于，步驟(3)中，所述的熒光染料為H33342。