[發明專利]一種基于DPW基因的轉基因水稻不育系的培育方法

在審

• 申請號: 201810728402.1
• 申請日: 2018-07-04
• 公開（公告）號: CN108949808A
• 公開（公告）日: 2018-12-07
• 發明（設計）人: 張國棟;劉佳音;米鐵柱;張志勇;羅碧;修旺珊
• 申請（專利權）人: 青島袁策集團有限公司
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/65;C12N15/66;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 北京華仁聯合知識產權代理有限公司 11588
• 代理人: 李冰

本申請公開了一種基于DPW基因的轉基因水稻不育系的培育方法，包括以下步驟：A、mCherry基因表達盒的獲得；B、玉米花粉致死基因ZMAA1的擴增；C、水稻基因表達盒DPW的獲得；D、玉米花粉特異性啟動子Pg47的擴增；E、各基因表達元件的連接。所述步驟E、各基因表達元件的連接，包括：將mCherry基因表達元件和玉米花粉致死基因ZMAA1連接到pCAMBIA1300載體上，再將完整的水稻DPW基因、玉米花粉特異性啟動子Pg47引入到載體上。本發明F1代雜合體在自交結實過程中遵循孟德爾分離定律，產生的后代既有能保持三連鎖基因的雜合體，又有無育性的不育系。

技術領域

本發明屬于基因工程遺傳育種學技術領域，具體涉及一種基于DPW基因的轉基因水稻不育系的培育方法。

背景技術

水稻原產亞洲熱帶，在中國廣為栽種后，逐漸傳播到世界各地。水稻是世界上近一半的人口的主食，除可食用外，還可以釀酒、制糖和作為工業原料大。多年來的生產實踐表明，雜交水稻一般可比常規稻增產20％以上，因此雜交水稻彰顯著巨大的增產潛力。

雜交水稻的發展依賴于雜交水稻不育系的培育。我國雜交水稻的研究始于上個世紀60年代，70年代開始大規模被種植。第一代雜交水稻是以核質互作雄性不育系為遺傳工具的三系法，第二代雜交水稻是以光溫敏雄性不育系為遺傳工具的兩系法，“三系法”和“兩系法”雜交育種技術對糧食增產貢獻巨大，但也存在問題。三系法中可利用的具有優良形狀的父母本有限，配組不自由，野敗保持系頻率較低。

生產上現有的不育系間遺傳差異小，雜交種育性穩定性不夠，抵御逆境能力較差。而“兩系法”中光溫敏雄性不育系的育性受外界溫度控制，易導致光溫敏不育系自交結實，制種失敗。因此開發新一代不育系對雜交水稻的發展至關重要。

水稻DPW基因是bHLH轉錄因子中的一員，bHLH轉錄因子大部分參與花藥絨氈層的發育或小孢子發育。花藥絨氈層對花粉的生長發育至關重要，絨氈層分泌的胼胝質酶能夠適時地分解花粉母細胞和四分體的胼胝質壁，以保證小孢子彼此分離。而水稻DPW基因突變后會導致絨氈層細胞不能及時降解，程序性死亡延遲，從而絨氈層分泌的胼胝質酶影響到小孢子的發育和分離，最終表現為不育。

玉米花粉致死基因ZMAA1可導致特定基因型玉米雄的雄配子(花粉)發生敗育夭折。Pg47啟動子是玉米花粉發育后期表達的特異性啟動子。利用Pg47啟動子來調控Ki基因，可以水解花粉中的淀粉，從而使花粉不育。

發明內容

本發明將水稻普通核不育基因DPW與小麥花粉致死基因Ki連鎖，同時以紅色熒光蛋白基因mCherry作為報告基因，對水稻DPW突變體進行基因改造，獲得F1代雜合體。F1代雜合體在自交結實過程中遵循孟德爾分離定律，產生的后代既有能保持三連鎖基因的雜合體，又有無育性的不育系。

為實現上述發明目的，本發明采用以下技術方案予以實現：

一種基于DPW基因的轉基因水稻不育系的培育方法，其特征在于它包括以下步驟：

A、mCherry基因表達盒的獲得；

B、玉米花粉致死基因ZMAA1的擴增；

C、水稻基因表達盒DPW的獲得；

D、玉米花粉特異性啟動子Pg47的擴增；

E、各基因表達元件的連接。

所述步驟E、各基因表達元件的連接步驟包括：

第一步，利用上下游引物中引入的VspI和KpnI酶切位點和pCAMBIA1300雙元載體上VspI和Kpn1酶切位點，將mCherry基因表達元件連接到pCAMBIA1300載體上；