[發明專利]一種基于DPW基因的轉基因水稻不育系的培育方法

在審

• 申請號: 201810728402.1
• 申請日: 2018-07-04
• 公開（公告）號: CN108949808A
• 公開（公告）日: 2018-12-07
• 發明（設計）人: 張國棟;劉佳音;米鐵柱;張志勇;羅碧;修旺珊
• 申請（專利權）人: 青島袁策集團有限公司
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/65;C12N15/66;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 北京華仁聯合知識產權代理有限公司 11588
• 代理人: 李冰

1.一種基于DPW基因的轉基因水稻不育系的培育方法，其特征在于它包括以下步驟：

A、mCherry基因表達盒的獲得；

B、玉米花粉致死基因ZMAA1的擴增；

C、水稻基因表達盒DPW的獲得；

D、玉米花粉特異性啟動子Pg47的擴增；

E、各基因表達元件的連接。

2.根據權利要求1所述基于DPW基因的轉基因水稻不育系的培育方法，其特征在于所述步驟E、各基因表達元件的連接步驟包括：

第一步，利用上下游引物中引入的VspI和KpnI酶切位點和pCAMBIA1300雙元載體上VspI和Kpn1酶切位點，將mCherry基因表達元件連接到pCAMBIA1300載體上；

第二步，利用上下游都引入的Af12酶切位點，將玉米花粉致死基因ZMAA1通過單酶切位點連接到已經連有水稻mCherry基因表達元件的pCAMBIA1300雙元載體上；

第三步，連接DPW，利用上下游引物中引入的Smal和BspXI酶切位點和pCAMBIA1300雙元載體上的Smal和BspXI酶切位點，將完整的水稻DPW基因連接到前兩步已經連接上mCherry基因表達元件、玉米花粉致死基因ZMAA1的pCAMBIA1300載體上；

第四步，利用上下游引物中引入Kpn I和Sma I酶切位點和pCAMBIA1300雙元載體上的Kpn I和Sma I酶切位點，將玉米花粉特異性啟動子Pg47連接到前三步已經連接上mCherry基因表達元件和玉米花粉致死基因ZMAA1和水稻基因表達元件DPW的pCAMBIA1300載體上。

3.根據權利要求1所述基于DPW基因的轉基因水稻不育系的培育方法，其特征在，所述步驟A、mCherry基因表達盒的獲得，進一步包括：

以含有mCherry基因完整表達盒的質粒為模板，以F1/R1為上下游引物進行擴增，擴增過程中分別在上下游引物中引入VspI和Kpn I位點，同時在下游引物引入的KpnI位點前面加入Afl2酶切位點。

4.根據權利要求1所述基于DPW基因的轉基因水稻不育系的培育方法，其特征在，所述步驟B、玉米花粉致死基因ZMAA1的擴增，進一步包括：

以玉米DNA為模板，以F3/R3為上下游引物進行玉米花粉致死基因ZMAA1的擴增，在上下游引物中引入Afl2酶切位點；其擴增的致死基因ZMAA1包含所有的外顯子和內含子。

5.根據權利要求1所述基于DPW基因的轉基因水稻不育系的培育方法，其特征在，所述步驟C水稻基因表達盒DPW的獲得，進一步包括：

提取水稻植株的基因組DNA，以基因組DNA為模板，以F2/R2為上下游引物進行完整DPW基因表達盒的擴增，擴增過程中分別在上游引物和下游引物中引入Sma I和BspXI酶切位點，其擴增的水稻DPW基因包含其上游的啟動子和下游的終止子，同時包含所有的外顯子和內含子。

6.根據權利要求1所述基于DPW基因的轉基因水稻不育系的培育方法，其特征在，所述步驟D、玉米花粉特異性啟動子Pg47的擴增，進一步包括：

以玉米組DNA為模板，以F4/R4為上下游引物進行花粉特異性啟動子Pg47擴增，在上下游引物中分別引入Kpn I和Sma I酶切位點。

7.權利要求1～6中任一項所述方法選育的基于DPW基因的轉基因水稻不育系。

8.權利要求1～6中任一項所述基于DPW基因的轉基因水稻不育系的培育方法在水稻不育系育種中的應用。