[發明專利]一種用于檢測四種常見根結線蟲的RPA引物、試劑盒及檢測方法

有效

• 申請號: 201810726124.6
• 申請日: 2018-07-04
• 公開（公告）號: CN108559783B
• 公開（公告）日: 2022-04-15
• 發明（設計）人: 鞠玉亮;操海群;潘月敏;林宇;吳慧平
• 申請（專利權）人: 安徽農業大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 尹明明

本發明公開了一種用于檢測四種常見根結線蟲的RPA引物、試劑盒及檢測方法，屬于生物安全技術領域；所述的RPA引物為如下四組：用于檢測南方根結線蟲的RPA引物對、用于檢測爪哇根結線蟲的RPA引物對、用于檢測花生根結線蟲的RPA引物對、用于檢測象耳豆根結線蟲的RPA引物對。本發明還提供含有所述的RPA引物的試劑盒。本發明進一步提供基于所述的RPA引物建立的檢測方法，以樣品中提取的DNA為模板進行RPA擴增反應；本發明首次將RPA技術應用到四種常見根結線蟲的分子檢測，其兼具特異性強、靈敏度高、檢測效率高、對儀器設備要求較低的特點，對根結線蟲病的現場檢測、早期診斷和指導科學施藥具有重要意義。

技術領域

本發明屬于生物安全技術領域，具體地說，涉及一種用于檢測四種常見根結線蟲的RPA引物、試劑盒及檢測方法。

背景技術

根結線蟲(Meloidogyne spp.)是一類嚴重危害農業生產的植物線蟲，能寄生蔬菜、果樹、花卉和雜草等幾乎所有維管植物，每年在世界范圍內造成的農業損失高達百億美元。目前，已報到的根結線蟲已超過100個種，其中，危害較為嚴重的主要為南方根結線蟲(M.incognita)、爪哇根結線蟲(M.javanica)、花生根結線蟲(M.arenaria)、北方根結線蟲(M.hapla)和象耳豆根結線蟲(M.enterolobii)。近年來，隨著我國種植結構的調整和設施蔬菜種植規模的擴大，特別是蔬菜大棚連作、四季重茬現象嚴重，導致根結線蟲危害日趨嚴重。由于高毒化學農藥的禁用以及抗病品種單基因抗性易喪失等問題的出現，使根結線蟲的防治面臨重大挑戰。因此，快速準確鑒定根結線蟲的種類對根結線蟲病的測報、選擇積極的防治策略提供有效手段。

根結線蟲種類鑒定常用手段主要包括傳統的形態學鑒定、基于蛋白的同工酶鑒定技術和基于DNA的分子檢測技術。形態學鑒定主要以雌蟲會陰花紋、二齡幼蟲頭部和尾部作為重要的分類形狀，該方法耗時長、需要較強的專業技能，難以推廣使用。同工酶鑒定技術通過酯酶和蘋果酸脫氫酶的酶譜表型來區分根結線蟲不同種類，該方法只適用于鑒定雌蟲，不使用于二齡幼蟲和其它齡期根結線蟲的鑒定，此外，該技術操作復雜、耗時長的不足也極大限制其應用。基于DNA的分子檢測技術是根結線蟲最常用的檢測手段，主要包括隨機擴增多態性DNA技術(RAPD)、特異引物PCR技術、實時熒光定量PCR技術(Real-time PCR)和環介導等溫擴增技術(LAMP)。PCR技術和Real-time PCR技術具備準確、高效、靈敏度高的特點，同時可實現對根結線蟲的定量檢測，但該技術對儀器設備、實驗條件、人員專業素質要求較高的缺點。LAMP技術可在65℃恒溫1h完成檢測反應，對儀器設備要求較低，但其反應體系需要6條引物，且易出現假陽性。鑒于此，繼續開發精確、高效、對儀器設備要求低的根結線蟲檢測技術具有重要的實踐價值。

重組酶聚合酶擴增技術(Recombinase polymerase amplification，RPA)是一種新型的恒溫擴增技術，其反應過程包括三種核心酶：重組酶(Recombinase)、單鏈結合蛋白(SSB)和DNA聚合酶(Ploymerase)。具體反應原理為：1)重組酶在ATP的參與下RPA引物結合形成核蛋白微絲，核蛋白微絲可向模板DNA移動，將引物序列與模板DNA序列進行比對；2)當引物與模板DNA發生堿基互補配對時，核蛋白微絲與模板DNA發生重組反應，并在單鏈結合蛋白的作用下，模板DNA解鏈；3)在DNA聚合酶的作用下，發生DNA的指數級擴增，形成新的DNA擴增產物。RPA技術只需一對30bp-35bp的引物，在37℃-45℃恒溫反應20min即可完成擴增反應，檢測時間較用常用分子檢測手段大大降低。目前，RPA技術已廣泛應用于病毒、細菌、支原體和動物寄生線蟲的快速檢測中，但尚未見其根結線蟲檢測方面的報道。

發明內容

1、要解決的問題

針對四種常見根結線蟲尚無有效運用RPA技術進行檢測的問題，本發明提供一種用于檢測四種常見根結線蟲的RPA引物、試劑盒及檢測方法，它可以顯著高檢測效率，為四種常見根結線蟲的早期診斷和現場快速檢測提供新技術。

2、技術方案