[發明專利]一種利用MsPALM1 人工定點突變體獲得多葉型紫花苜蓿材料的方法

有效

• 申請號: 201810724563.3
• 申請日: 2018-07-04
• 公開（公告）號: CN108949774B
• 公開（公告）日: 2021-05-04
• 發明（設計）人: 陳海濤;王文;謝雄平;邱強;尚占環;蘇克先;何輝
• 申請（專利權）人: 廣東三杰牧草生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C07K14/415;C12N15/82;A01H5/12;A01H6/54
• 代理公司: 北京化育知識產權代理有限公司 11833
• 代理人: 尹均利

本發明提供一種利用MsPALM1人工定點突變體獲得多葉型紫花苜蓿材料的方法，首先在紫花苜蓿復葉發育調控基因MsPALM1外顯子區選取靶標片段并構建植物CRISPR/Cas9打靶重組載體MsCRISPR/Cas9::PALM1，導入紫花苜蓿細胞并再生成苗，通過剪切后修復造成紫花苜蓿細胞MsPALM1基因出現功能缺失突變，再通過對再生株系基因組目標片段的限制性內切酶酶切和/或靶點深度測序篩選突變植株，獲取攜帶四個等位MsPALM1基因同時發生功能缺失突變的株系，經過表型鑒定，確認再生植株復葉由三片小葉轉為五片小葉。實驗表明，本方法可快速獲得多葉型紫花苜蓿材料，育種周期短，所獲材料除變為五出羽狀復葉之外其他農藝性狀不變，性狀穩定，可快速獲得四個等位基因均突變的可穩定遺傳的純合突變體。

技術領域

本發明屬于紫花苜蓿生物技術育種領域，具體涉及一種利用MsPALM1人工定點突變體獲得多葉型紫花苜蓿材料的方法。

背景技術

紫花苜蓿(Medicago sativa L.),是一種栽培歷史悠久的多年生優質豆科牧草，具有適應性強、營養價值高、種植區域廣、生態功能齊全、經濟效益高等特點。它是多年生豆科牧草，是世界上種植面積最大的牧草品種，素有“牧草之王”的美譽。紫花苜蓿在我國已有兩千多年的栽培歷史，目前，我國紫花苜蓿種植的留床面積約146.7萬多公頃。目前生產水平：干草產量平均13-17t/hm2，種子產量平均為375-600kg/hm²。所以說，中國的草產業主要是紫花苜蓿的產業化，其在農業和畜牧業發展中具有十分重要的價值和地位。培育產草量和蛋白質含量高的品種，對促進我國牧草優質生產和畜牧業發展具有重要意義。

紫花苜蓿的蛋白質含量主要集中于葉片中，且葉片性狀與產量性狀相關。紫花苜蓿的葉子一般為三出羽狀復葉，檢測數據顯示：紫花苜蓿60-70％的粗蛋白質和90％的維生素存在于葉片中，因此優質苜蓿應該是多葉的。由此確定了我們的育種目標為多葉性狀，即通過變異獲得具有多于3個小葉的多出羽狀復葉的苜蓿被稱為多葉型苜蓿。苜蓿多葉性狀被認為具有高產和優質的潛力，培育多葉性狀的優良苜蓿對開發與利用高品質苜蓿具有重要作用。苜蓿的多葉性狀在自然界中也有發現，已有研究結果表明：多葉型苜蓿與三葉型苜蓿相比，其光合效率、比葉重、莖葉比等生長特性明顯增加；此外，苜蓿多葉性狀能增加苜蓿的葉面積，苜蓿產草量與葉面積呈正相關；多葉型苜蓿品系產草量明顯高于三葉型苜蓿品種；但是苜蓿的多葉性狀不穩定，苜蓿多葉性狀存在隱藏現象。

雖然多葉型材料品系在紫花苜蓿優質新品種培育具有廣闊的應用前景，但是天然的遺傳突變資源有限，且紫花苜蓿是異花授粉的同源四倍體植物，具有自交不親和的特性，通過傳統的雜交技術獲得純合的可穩定遺傳的紫花苜蓿新品種，育種周期漫長，可行性不高。經檢索，專利號為CN104737899B-一種航天誘變多葉型紫花苜蓿選育方法的專利，選育出我國第一個航天誘變多葉型紫花苜蓿新品種，但是這種方法成本高，條件要求十分苛刻，多代雜交選育，反復篩選，而且不穩定，所耗費時間長，可重復操作性不強。

在紫花苜蓿的近源物種蒺藜苜蓿的研究成果中，我們發現調控葉原基發育的主效基因是PALM1基因，該基因為單拷貝的具有單一外顯子的基因，該基因的隱性純合突變體具有五出羽狀復葉。高效的定點基因編輯技術同時沉默紫花苜蓿的四個等位的MsPALM1基因可能快速創制出具有多葉性狀的可穩定遺傳的紫花苜蓿新品種。因此，我們希望獲得一種利用紫花苜蓿復葉發育調控基因MsPALM1人工定點突變體獲得多葉型紫花苜蓿材料的方法，同時沉默紫花苜蓿的四個等位的MsPALM1基因，快速定向獲得多葉型紫花苜蓿材料。

發明內容

針對上述問題，本發明提供了一種利用MsPALM1人工定點突變體獲得多葉型紫花苜蓿材料的方法，該方法包括以下步驟：

步驟(1)在紫花苜蓿復葉發育調控基因MsPALM1外顯子區選取靶標片段；其中，所述靶標片段的雙鏈結構中的一條鏈具有NGG結構，其中N代表堿基A、T、C、G中的任意一種；