[發明專利]一種利用MsPALM1 人工定點突變體獲得多葉型紫花苜蓿材料的方法

有效

• 申請號: 201810724563.3
• 申請日: 2018-07-04
• 公開（公告）號: CN108949774B
• 公開（公告）日: 2021-05-04
• 發明（設計）人: 陳海濤;王文;謝雄平;邱強;尚占環;蘇克先;何輝
• 申請（專利權）人: 廣東三杰牧草生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C07K14/415;C12N15/82;A01H5/12;A01H6/54
• 代理公司: 北京化育知識產權代理有限公司 11833
• 代理人: 尹均利

1.一種利用MsPALM1人工定點突變體獲得多葉型紫花苜蓿材料的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

步驟(1)在紫花苜蓿復葉發育調控基因MsPALM1外顯子區設計靶序列；其中，所述靶序列的雙鏈結構中的一條鏈具有NGG結構，其中N代表堿基A、T、C、G中的任意一種；

步驟(2)按照靶序列的核苷酸排列順序，構建用于紫花苜蓿MsPALM1基因打靶的由根癌農桿菌介導轉化的雙元表達載體MsCRISPR/Cas9::PALM1，所述雙元表達載體MsCRISPR/Cas9::PALM1包含sgRNA表達框和Cas9核酸酶表達框，所述sgRNA表達框包含所述MsPALM1靶標片段；

步驟(3)將所述雙元表達載體MsCRISPR/Cas9::PALM1通過根癌農桿菌轉化導入紫花苜蓿細胞，使所述sgRNA表達框和所述Cas9核酸酶表達框在紫花苜蓿細胞中共同表達，剪切MsPALM1基因的雙鏈的所述靶標片段，誘發所述紫花苜蓿細胞自身的DNA修復功能，在靶標位點隨機插入或缺失堿基，實現細胞內MsPALM1基因的功能缺失突變；

步驟(4)，用步驟3中所述的紫花苜蓿細胞再生植株；

步驟(5)，將步驟4中所得的再生植株中MsPALM1基因包含靶標片段的DNA區段進行PCR擴增后，使用限制性內切酶酶切檢測和/或靶點深度測序檢測；

步驟(6)，選擇四個等位基因都出現功能缺失突變的再生植株，進行表型鑒定，觀察所述再生植株的復葉表型，挑取所有復葉完全表現多于3個小葉的植株，作為所創制的多葉型紫花苜蓿材料；

所述靶標片段的雙鏈結構中的一條鏈具有5’-G(N)x-NGG-3’結構，其中(N)x表示數目為x的一條堿基序列{N,N······Nx},N,N······Nx中的每一個表示A、G、C、T中的任意一個；

所述sgRNA表達框能夠在紫花苜蓿細胞內表達并且核苷酸序列如Seq ID NO.1所示；

所述Cas9核酸酶表達框能夠在紫花苜蓿細胞內表達并且核苷酸序列如Seq ID NO.2所示；

所述sgRNA表達框包括：蒺藜苜蓿MtU6啟動子，其核苷酸序列如Seq IDNO.1第1至500位所示；結構特征為(N)x的靶標序列和人工合成的sgRNA骨架序列，其核苷酸序列如Seq IDNO.1第501至606位所示；和Poly-T終止子，其核苷酸序列如Seq ID NO.1第607至615位所示，所述Cas9核酸酶表達框包括：CaMV 35S啟動子，其核苷酸序列如Seq ID NO.2第1至345位所示；Cas9編碼序列，Seq ID NO.2第487至4756位所示；以及tNOS終止子，Seq ID NO.2第4794至5046位所示。

2.根據權利要求1所述的利用MsPALM1人工定點突變體獲得多葉型紫花苜蓿材料的方法，其特征在于，所述sgRNA表達框包括CRISPR RNA序列，其具有所述靶標片段的5’-G(N)x-NGG-3’中的G(N)x或與之互補的序列。

3.根據權利要求1所述的利用MsPALM1人工定點突變體獲得多葉型紫花苜蓿材料的方法，其特征在于，所述靶標片段的5’-G(N)x-NGG-3’中的G(N)x或與之互補的序列包含序列：5’-GGAGACGAGCACGGTCGCGG-3’，該序列為MsPALM1基因單一外顯子中自翻譯起始密碼子ATG后第323-343位的核苷酸序列5’-CCGCGACCGTGCTCGTCTCC-3’的反向互補序列。

4.如權利要求3所述的利用MsPALM1人工定點突變體獲得多葉型紫花苜蓿材料的方法，其特征在于所述靶標片段中包含一個BstUⅠ限制性內切酶酶切位點。

5.如權利要求1-4任一權利要求所述的利用MsPALM1人工定點突變體獲得多葉型紫花苜蓿的方法在紫花苜蓿育種和基因編輯紫花苜蓿育種中的應用。