[發明專利]檢測鼻腔脫落細胞中CLC基因表達量的方法及應用

在審

• 申請號: 201810719334.2
• 申請日: 2018-07-03
• 公開（公告）號: CN108977510A
• 公開（公告）日: 2018-12-11
• 發明（設計）人: 張羅;王成碩;閆冰;劉暢
• 申請（專利權）人: 張羅;王成碩;閆冰;北京市耳鼻咽喉科研究所;首都醫科大學附屬北京同仁醫院
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/6883
• 代理公司: 北京智匯東方知識產權代理事務所(普通合伙) 11391
• 代理人: 康正德;陳智勇

1.一種檢測鼻腔脫落細胞中CLC基因表達量的方法，其特征在于：包括以下步驟：從鼻腔脫落細胞中提取RNA，將總RNA逆轉錄為cDNA，采用定量聚合酶鏈反應將cDNA中的CLC基因和內參基因分別采用CLC基因的特異性引物和內參基因的特異性引物進行實時熒光定量PCR擴增，基于擴增產物的檢測結果計算CLC基因表達量。

2.根據權利要求1所述的檢測鼻腔脫落細胞中CLC基因表達量的方法，其特征在于：CLC基因的上游引物如SEQ ID NO:2所示，CLC基因的下游引物如SEQ ID NO:3所示；

所述內參基因為GAPDH，所述內參基因的上游引物如SEQ ID NO:4所示，所述下游引物如SEQ ID NO:5所示。

3.根據權利要求1所述的檢測鼻腔脫落細胞中CLC基因表達量的方法，其特征在于：所述鼻腔脫落細胞采用毛刷于鼻息肉表面獲取，且將獲取鼻腔脫落細胞后的毛刷置于細胞裂解液中于4℃以下保存。

4.根據權利要求1所述的檢測鼻腔脫落細胞中CLC基因表達量的方法，其特征在于：從鼻腔脫落細胞中提取RNA的方法，包括以下步驟：

步驟1：將所述鼻腔脫落細胞溶解于100～2000μL細胞裂解液中，并加入等體積的乙醇，混合均勻后加入至RNA純化柱中，離心處理后，除去濾液，將所述RNA純化柱置于收集管中；

步驟2：向步驟1中獲取的所述RNA純化柱中加入300μL～700μL的第一緩沖液，離心處理后，除去第一濾液；繼續向所述RNA純化柱加入400μL～800μL第二緩沖液，離心處理后，除去第二濾液，取RNA純化柱經洗脫得到RNA。

5.根據權利要求4所述的檢測鼻腔脫落細胞中CLC基因表達量的方法，其特征在于：從鼻腔脫落細胞中提取RNA的方法，還包括以下步驟：向除去所述第二濾液后的RNA純化柱中添加10～100μLDNA酶反應液，經靜置處理后，加入300μL～700μL所述第二緩沖液，離心處理后，除去第三濾液，取RNA純化柱經洗脫后采用分光光度計測量RNA純度，得到RNA；

所述DNA酶反應液的制備方法包括以下步驟：取DNA酶緩沖液、重組DNA酶，去RNA酶的雙蒸水經混合得到DNA酶反應液。

6.根據權利要求4所述的檢測鼻腔脫落細胞中CLC基因表達量的方法，其特征在于：從鼻腔脫落細胞中提取RNA的方法，還包括以下步驟：所述步驟1中，所述鼻腔脫落細胞溶解于細胞裂解液中后先加入至基因組DNA吸附柱中取濾液，再向所述濾液中加入等體積的乙醇。

7.根據權利要求4～6任一項所述的檢測鼻腔脫落細胞中CLC基因表達量的方法，其特征在于：從鼻腔脫落細胞中提取RNA的方法，還包括以下步驟：取待洗脫的RNA純化柱加入去RNA水解酶的蒸餾水或焦碳酸二乙酯處理水，室溫靜置后，經離心處理、洗脫所述RNA純化柱，采用分光光度計測量RNA純度，得到RNA。

8.根據權利要求1所述的檢測鼻腔脫落細胞中CLC基因表達量的方法，其特征在于：從鼻腔脫落細胞中提取RNA的方法，包括以下步驟：向裝有鼻腔脫落細胞的離心管中加入0.1mL～20mLRNA抽提液進行溶解、振蕩后加入所述RNA抽提液體積的0.1～0.5倍的氯仿，震蕩混勻，室溫靜置，將所述離心管離心，取上清液，加入所述氯仿體積的0.5～3倍的異丙醇，混勻后靜置、離心，棄上清，保留第一沉淀，向所述第一沉淀中加入所述異丙醇體積的0.5～5倍的濃度65％～90％的乙醇，經洗滌后混勻、離心，棄上清，保留第二沉淀；蓋緊離心管，再次離心，除去上清液，繼續向所述離心管中加入0.01～5mL去RNA酶及去DNA酶的水溶解所述第二沉淀，采用分光光度計測量RNA純度，得到RNA；

所述RNA抽提液為Trizol、RNAiso Blood、RNAiso Plus或其它含有苯酚、異硫氰酸胍、8－羥基喹啉、異硫氰酸胍和β-巰基乙醇中的任一種或幾種的試劑。