[發明專利]一種豬圓環病毒2型病毒樣顆粒的分離純化方法

有效

• 申請號: 201810712312.3
• 申請日: 2018-07-03
• 公開（公告）號: CN108611327B
• 公開（公告）日: 2022-03-18
• 發明（設計）人: 呂紅;周峻崗;段進坤;楊德強
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12N7/02
• 代理公司: 上海德昭知識產權代理有限公司 31204
• 代理人: 郁旦蓉

為解決豬圓環病毒2型病毒樣顆粒的分離純化中的步驟復雜、工藝繁瑣、生產成本高、純化效率低等問題，本發明提供了一種豬圓環病毒2型病毒樣顆粒的分離純化方法，包括如下步驟：步驟S1，收集重組酵母細胞并進行破碎，獲得含豬圓環病毒2型病毒樣顆粒的細胞裂解液；步驟S2，對細胞裂解液進行澄清獲得病毒樣顆粒初提液；步驟S3，對病毒樣顆粒初提液進行離子交換層析獲得病毒樣顆粒粗純液；步驟S4，對病毒樣顆粒粗純液進行超濾濃縮獲得病毒樣顆粒濃縮液；步驟S5，對病毒樣顆粒濃縮液進行凝膠過濾層析純化，獲得純化后的病毒樣顆粒，其中，步驟S3的離子交換層析中，吸附過程及洗脫過程中所采用的緩沖液均含有預定濃度的表面活性劑。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及病毒樣顆粒的分離純化方法，具體涉及一種豬圓環病毒2型病毒樣顆粒的分離純化方法。

背景技術

豬圓環病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)是屬于圓環病毒科(Circoviridae)、圓環病毒屬(Circovirus)的DNA病毒，其核酸分子為單股、首尾閉合的環狀結構，無囊膜。PCV2本身不致死豬，但可造成免疫抑制。PCV2是斷奶仔豬多系統衰竭綜合征(PMWS)的主要病原，當與其它病原混合感染時，可加重病豬的死亡，給養殖業帶來巨大的損失。PCV2已成為危害養豬業的主要疫病之一，在豬群中感染率較高，疫苗是防控PCV2的有效工具，免疫接種可以減少PCV2對免疫豬的危害程度及其組織病毒載量，也為豬場進行PCV2的凈化提供了基礎條件。目前市場上的PCV2商品化疫苗主要有全病毒滅活苗和亞單位疫苗兩種：全病毒滅活苗方面，由于病毒自身特點和生產工藝的弊端，經常出現病毒滴度難以提高等技術問題，且其有效抗原純度較低，免疫接種后經常出現不同程度的不良反應。

豬圓環病毒亞單位疫苗主要是使用真核或原核表達系統高效表達Cap蛋白，Cap蛋白經自組裝形成病毒樣顆粒(Virus-like Particle，VLP)，經純化后可制備病毒樣顆粒疫苗。VLP的形態結構與天然病毒高度相似，免疫原性良好，且不含有病毒基因，因此是一種理想的疫苗形式。目前，大多數商用PCV2亞單位疫苗使用昆蟲桿狀病毒表達系統表達重組Cap蛋白，但該系統表達時間長且成本昂貴；而大腸桿菌等原核表達系統不能對重組蛋白進行翻譯后修飾，且需要考慮內毒素的去除。酵母細胞是比原核生物更好的表達系統，不僅能解決原核系統的內毒素問題，還可對表達的蛋白進行糖基化修飾，表達水平高，易于放大，且相較于其他真核表達系統成本更為低廉。

基于上述原因，本發明的發明人構建了重組表達豬圓環病毒2型病毒樣顆粒(即PCV2VLPs)的馬克斯克魯維酵母，并針對重組獲得的菌株申請了發明專利(即CN201610806538.0)。然而，發明人在進行該重組酵母的提取純化研究時發現，現有技術中病毒樣顆粒的純化方法常采用沉淀法、梯度離心、陰離子交換層析和分子排阻層析等，存在步驟復雜、工藝繁瑣、生產成本高、純化效率低等諸多問題。

發明內容

為解決上述問題，本發明的發明人首先進行了PCV2Cap蛋白的序列分析，發現在PCV2Cap蛋白的234個氨基酸中，有強堿性氨基酸精氨酸、賴氨酸和組氨酸的殘基數達41個，而強酸性氨基酸天冬氨酸和谷氨酸的殘基數僅16個，PCV2cap蛋白的理論等電點約為10.8，因此在常規的純化緩沖體系(pH6-8)中PCV2VLPs表面極有可能是帶正電荷。因此，采用陽離子交換層析可以較好地分離出PCV2VLPs。

此外，酵母細胞在高壓破碎的過程中，細胞內的多糖類等帶負電的物質大量釋放，可能與PCV2VLPs通過離子作用結合到一起，中和了PCV2VLP表面的正電荷，影響陽離子交換層析分離純化PCV2VLP的效率，因此，在進行陽離子交換層析過程中，通過補加特定的表面活性劑，同時增強緩沖體系中的離子強度，就能夠顯著提高PCV2VLP的純化效率。

經過以上分析，為達到建立高效的PCV2VLPs純化工藝的目的，發明人在本發明中提出了基于陽離子交換層析并在陽離子交換層析中補加特定的表面活性劑的分離純化方法。具體地，本發明采用了如下技術方案：