[發(fā)明專利]一種高質(zhì)量可放大型魚膠原蛋白提取純化方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810711297.0
• 申請(qǐng)日: 2018-06-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108642115A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-10-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫粵;年銳;咸漠;包子?jì)?/a>;陳泉;劉文帥;樊喜英
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所
• 主分類號(hào): C12P21/06
• 分類號(hào): C12P21/06;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/30
• 代理公司: 哈爾濱市陽(yáng)光惠遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 鄧宇

本發(fā)明公開(kāi)了一種高質(zhì)量可放大型魚膠原蛋白提取純化方法，屬于魚膠原蛋白提取純化技術(shù)領(lǐng)域。該方法是將凍干魚皮剪碎后加入氫氧化鈉溶液和過(guò)氧化氫溶液的混合溶液，攪拌后離心；向沉淀中加入異丙醇溶液，攪拌后離心；向沉淀中加入鹽酸胍溶液，攪拌離心；向沉淀中加入乙酸溶液，再加入胃蛋白酶，攪拌后離心；向上清液中邊攪拌邊滴加入氯化鈉?乙酸母液，攪拌后離心；向沉淀中加入乙酸溶液溶解沉淀后透析；透析后將透析袋內(nèi)的沉淀溶解于乙酸溶液中，加到正壓過(guò)濾設(shè)備，用微孔濾膜過(guò)濾上清得蛋白溶液；先用乙酸溶液透析，再用水透析，得到膠原凝膠，凍干后即得膠原蛋白。獲得的蛋白產(chǎn)物結(jié)構(gòu)完整，生物活性保持完好，可直接用于醫(yī)用及組織工程材料。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種高質(zhì)量可放大型魚膠原蛋白提取純化方法，屬于魚膠原蛋白提取純化技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

膠原蛋白是廣泛存在于皮膚、血管、骨骼與腦膜等多種結(jié)締組織中的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，在動(dòng)物的生長(zhǎng)、發(fā)育以及結(jié)構(gòu)的維持、穩(wěn)定與保護(hù)過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。在前期的研究中也發(fā)現(xiàn)，作為細(xì)胞基質(zhì)中的主要成分，膠原蛋白的存在可以為創(chuàng)口處的細(xì)胞提供貼附場(chǎng)所，并能夠輔助多種生長(zhǎng)因子作用于細(xì)胞，從而促進(jìn)細(xì)胞的分裂與分化，進(jìn)而促進(jìn)創(chuàng)口的再生；同時(shí)，膠原蛋白材料之內(nèi)的纖維與空隙結(jié)構(gòu)可以使血小板細(xì)胞貼附、聚集，從而促進(jìn)血栓的形成并顯著的加速血液凝固，起到了很好的止血效果；另一方面，膠原蛋白可以抑制創(chuàng)口處部分負(fù)責(zé)降解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白酶活性，本身的降解物也可以直接作用于創(chuàng)口處，為組織的再生提供氨基酸補(bǔ)給，從而促進(jìn)創(chuàng)口處胞外基質(zhì)的生成與穩(wěn)定。因此，膠原蛋白的這些功能特性賦予了它在醫(yī)用材料、組織工程方面優(yōu)異的應(yīng)用前景。

我國(guó)具有廣闊的海岸線，因此具有豐富的水產(chǎn)資源。然而在加工魚類產(chǎn)品時(shí)，魚皮、魚骨等魚結(jié)締組織會(huì)被直接丟棄。而這些組織中含有豐富的膠原蛋白。利用這些魚類結(jié)締組織作為膠原蛋白的來(lái)源，可以有效的降低成本，并對(duì)于綠色海洋經(jīng)濟(jì)起到良好的促進(jìn)作用。

正常具有生物活性的三螺旋膠原蛋白是一種酸溶性蛋白，單鏈分子量在120kD左右在中性條件下會(huì)通過(guò)膠原蛋白之間的聚合及自組裝形成較大的蛋白結(jié)構(gòu)，繼而可通過(guò)自然/化學(xué)/物理交聯(lián)形成膠原蛋白材料，包括膠原凝膠及膠原海綿等。在這個(gè)過(guò)程中，膠原蛋白的結(jié)構(gòu)、質(zhì)量會(huì)直接影響到后續(xù)膠原材料的質(zhì)量和強(qiáng)度。因此，可用于組織工程及醫(yī)用材料的膠原蛋白不僅對(duì)于膠原蛋白本身的純度要求較高，同時(shí)對(duì)于膠原蛋白的原始結(jié)構(gòu)及蛋白完整性有著較高的要求。在一般的實(shí)驗(yàn)文獻(xiàn)所述的方法中，膠原蛋白的純化一般是通過(guò)氫氧化鈉洗滌去除部分雜蛋白，再通過(guò)醇類洗滌去除脂類，繼而在酸性條件下通過(guò)蛋白酶解獲得膠原蛋白溶液，利用氯化鈉鹽析獲得目的膠原蛋白。這樣的方法獲得的膠原蛋白生物活性得到保留，可以滿足蛋白分析以及實(shí)驗(yàn)的要求，但純度無(wú)法滿足體內(nèi)植入的要求，仍包含部分雜蛋白與雜質(zhì)，體內(nèi)植入后易引起排異反應(yīng)。同時(shí)，該純化方法的固液分離極度依賴離心設(shè)備，這意味著這種方法只能在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行小規(guī)模的純化，成本較高，無(wú)法進(jìn)行放大生產(chǎn)。同時(shí)在這類方法中，胃蛋白酶的活性沒(méi)有及時(shí)終止，這也容易造成蛋白的過(guò)渡消化，包括了提取率的降低及蛋白活性下降等。

現(xiàn)階段的膠原蛋白純化技術(shù)主要圍繞小分子膠原蛋白的提取，如在CN103993061A、CN104672323A、CN201710309865等專利中提到的純化技術(shù)。這一類分離、純化得到的膠原蛋白分子量一般在300-5000D之間，可溶于水，蛋白產(chǎn)物可以達(dá)到較高的純度。但這一類膠原蛋白由于失去了原始的結(jié)構(gòu)，無(wú)法用于組織工程材料的制備，其蛋白產(chǎn)物一般被應(yīng)用于美容、保健等方面。同時(shí)色譜柱體系的應(yīng)用會(huì)顯著性的限制相關(guān)方法的應(yīng)用，其純化方法難以進(jìn)行擴(kuò)大化，純化成本也會(huì)顯著提升。

在一些專利及文獻(xiàn)報(bào)道中，利用有機(jī)試劑沉淀(包括乙醇、丙酮等)等方法得到了純度較高的膠原蛋白。但在實(shí)際操作中，在最終的分離階段使用有機(jī)試劑易于造成蛋白質(zhì)的變性，使目的產(chǎn)物失去生物活性，同時(shí)有機(jī)試劑容易殘留在終產(chǎn)物中，從而造成安全隱患。