[發明專利]一種構建高效分泌表達細菌肝素水解酶重組菌的方法

在審

• 申請號: 201810710021.0
• 申請日: 2018-07-02
• 公開（公告）號: CN108841739A
• 公開（公告）日: 2018-11-20
• 發明（設計）人: 康振;陳堅;原攀紅;堵國成
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N9/42;C12N15/81;C12R1/84
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

本發明公開了一種構建高效分泌表達細菌肝素水解酶重組菌的方法，屬于酶工程技術領域。本發明采用畢赤酵母表達系統，構建一種表達肝素水解酶的方法。并在畢赤酵母表達系統中實現了肝素水解酶的分泌表達。是一種發酵產肝素水解酶的方法，對肝素水解酶的工業化生產起到了重要的推動作用。

技術領域

本發明涉及一種構建高效分泌表達細菌肝素水解酶重組菌的方法，屬于酶工程技術領域。

背景技術

多糖作為一種高分子碳水化合物，廣泛存在于動植物和微生物，具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、免疫調節等多種生物學活性。多糖主要有二糖單位組成，分為硫酸乙酰肝素、肝素、透明質酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素。多糖裂解酶主要以β消除的方式裂解肝素或硫酸乙酰肝素，主要來源于肝素黃桿菌，目前從中分離純化出三種肝素酶：肝素酶I、II、III，在低分子肝素制備及肝素類多糖分子結構解析領域具有十分重要的應用前景。對于包括肝素酶在內的幾乎所有多糖裂解酶，催化方式的單一性很大程度限制了其相應的應用。然而，對于這種催化底物的單一性，目前的理解僅限于推測，尚無直接的實驗證據，更無法實現不同結構多糖裂解酶間底物譜的轉化。

肝素水解酶是內切-β-葡萄糖醛酸酶屬于糖苷水解酶家族79，這種酶水解硫酸肝素，水解葡糖醛酸和氨基葡萄糖間的β1,4-糖苷鍵。肝素水解酶在癌細胞中過表達是眾所周知的，與血管生成、炎癥和增加的轉移潛能有關，因此，肝素水解酶是一種重要的潛在藥物目標。在35年前，Hook和他的同事們首先描述了一種硫酸乙酰肝素(HS)內切-β-D-葡糖醛酸糖苷酶，此后，陸續報道了這種活性存在各種細胞類型和組織。Heparanase在幾乎所有分析的人類腫瘤中都過表達，并且在腫瘤細胞的過表達與轉移潛能之間觀察到相關性。它似乎也是小鼠β細胞存活和自身免疫性糖尿病的關鍵。因此，肝素水解酶被認為對腫瘤細胞的侵襲和轉移具有重要意義，成為抗癌藥物發現的理想靶標。

目前生產肝素水解酶的方法為BL21，產量未報導，存在的問題為胞內表達未實現高效分泌表達。

發明內容

本發明的第一個目的是提供一種構建高效分泌表達細菌肝素水解酶重組菌，所述重組菌是以畢赤酵母Pichia pastoris GS115為宿主，表達來源于Burkholderiapseudomallei的肝素水解酶。

在本發明的一種實施方式中，所述肝素水解酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

在本發明的一種實施方式中，所述肝素水解酶基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本發明的第二個目的是提供一種所述的重組菌的構建方法是：將核苷酸序列為SEQ ID NO.1的肝素水解酶基因連接到表達載體pPIC9K上，然后轉化到畢赤酵母Pichiapastoris GS115中，篩選正確的轉化子，即得重組畢赤酵母Pichia pastoris GS115/pPIC9K-BpHEP。

在本發明的一種實施方式中，所述重組菌的構建方法在肝素水解酶基因上添加組氨酸標簽。

本發明的第三個目的是提供一種所述重組菌發酵生產肝素水解酶的方法，所述方法在發酵罐中，采用甲醇誘導策略發酵生產肝素水解酶。

在本發明的一種實施方式中，發酵方法具體步驟為：