[發明專利]一種構建高效分泌表達細菌肝素水解酶重組菌的方法

在審

• 申請號: 201810710021.0
• 申請日: 2018-07-02
• 公開（公告）號: CN108841739A
• 公開（公告）日: 2018-11-20
• 發明（設計）人: 康振;陳堅;原攀紅;堵國成
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N9/42;C12N15/81;C12R1/84
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

1.一種表達細菌肝素水解酶重組菌，其特征在在于，所述重組菌是以畢赤酵母Pichiapastoris GS115為宿主，表達來源于Burkholderia pseudomallei的肝素水解酶。

2.根據權利要求1所述的重組菌，其特征在在于，所述肝素水解酶的核苷酸序列如SEQID NO:1所示。

3.根據權利要求1所述的重組菌，其特征在在于，所述肝素水解酶基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

4.根據權利要求1所述的重組菌，其特征在在于，所述的重組菌的構建方法是：將核苷酸序列為SEQ ID NO.1的肝素水解酶基因連接到表達載體pPIC9K上，然后轉化到畢赤酵母Pichia pastoris GS115中，篩選正確的轉化子，即得重組畢赤酵母Pichia pastorisGS115/pPIC9K-BpHEP。

5.根據權利要求4所述的重組菌，其特征在在于，所述重組菌的構建方法在肝素水解酶基因上添加組氨酸標簽。

6.一種發酵生產肝素水解酶的方法，其特征在在于，所述方法是利用權利要求1-5任一所述的重組菌進行發酵生產。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法是在發酵罐中采用甲醇誘導策略發酵生產肝素水解酶。

8.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，發酵方法具體步驟為：

將搖瓶培養的YPD種子液以10％的接種量接種于3L全自動發酵罐(LiFlus GMBioTRON,Korea)中，溫度控制在25-30℃，使用25％氨水調節pH為5-6，初始攪拌轉速為500-1000r·min^-1，通氣量為2-4L·min^-1，溶氧維持在30％-35％以上。培養大約20-40h，OD₆₀₀約70-80待甘油耗盡，指數流加30-50％(W·V^-1)甘油溶液(含12mL·L^-1PTM1)，攪拌轉速與溶氧相關聯，控制轉速在500-1000r·min^-1補料12h，停止補料待甘油再次耗盡，OD₆₀₀約250(干重約60.0g·L^-1)，轉速在600-1000r·min^-1并流加100％甲醇(含12mL·L^-1PTM1)，甲醇濃度控制在18.0g·L^-1，誘導溫度分別采用30℃，25℃，22℃及階段控制溫度誘導策略。本發明的第四個目的是提供一種所述肝素水解酶分離純化的方法，具體步驟如下：離心發酵液，收集上清液，上樣；使用Ni柱，用磷酸鹽緩沖液平衡柱子10柱體積；采用咪唑梯度洗脫，咪唑用上述磷酸緩沖液配制，按照10mmol·L^-1，30mmol·L^-1，200mmol·L^-1梯度洗脫。