[發明專利]一種重組環氧琥珀酸水解酶、其編碼基因、其表達及其活力的測定方法

在審

• 申請號: 201810708588.4
• 申請日: 2018-07-02
• 公開（公告）號: CN108823223A
• 公開（公告）日: 2018-11-16
• 發明（設計）人: 楊艷;溫艷珍;吳永妮;胡建水
• 申請（專利權）人: 太原科技大學
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N9/14;C12N15/70;C12N1/21;C12P7/46;C12Q1/34
• 代理公司: 中山市興華粵專利代理有限公司 44345
• 代理人: 吳劍鋒

本發明公開了一種重組環氧琥珀酸水解酶，源自紅球菌RNA，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其編碼基因的序列如SEQ ID NO:2所示。本發明還提供了一種了該重組環氧琥珀酸水解酶的基因蛋白表達、純化及酶促反應動力學研究方法和結果，通過體外構建基于大腸桿菌的重組菌株，該重組菌株經過誘導后能將環氧琥珀酸(本發明所涉及的環氧琥珀酸均指順式環氧琥珀酸，以下同)高效轉化為L(+)?酒石酸。此外，本發明還提供一種測定方法，可快速測定該重組菌株中誘導表達的重組環氧琥珀酸水解酶活力。

技術領域

本發明涉及生物工程技術領域，具體涉及一種紅球菌中順式環氧琥珀酸水解酶的編碼基因，同時還涉及該基因在大腸桿菌工程菌株中表達，并對其發酵液利用紫外分光光度法和高效液相色譜法進行酶活力的測定。

背景技術

L(+)-酒石酸是一種重要中間體，被普遍的用作食品添加劑和各種藥物產品。在葡萄酒發酵中，L(+)-酒石酸作為其副產物亦可自然生成。目前L(+)-酒石酸被授權大量使用作為飲料、食品添加劑或生化試劑。在化工方面，通過使用順丁烯二酸可以化學合成酒石酸，但這個過程中會產生L(+)-酒石酸和D(+)-酒石酸混合物。研究發現，環氧化物水解酶可以水解順式環氧琥珀酸的環氧氧化產生L(+)-酒石酸。

環氧化物水解酶是一類能立體選擇性地將水分子加到環氧底物上生成相應的手性醇類物質的酶，在自然界廣泛存在。該酶同時具有降解生物體內外源或內源的潛在毒性代謝中間體、參與哺乳動物血壓調節、加強土壤細菌對病原體的防御等作用。環氧化物水解酶具有優良的立體選擇性(對映體選擇性和區域選擇性)，來源廣泛，大致分為哺乳動物環氧化物水解酶和微生物環氧化物水解酶兩大類，已發現在酵母、絲狀真菌、細菌中都存在大量的環氧化物水解酶。隨著微生物環氧化物水解酶種類增多，其應用方面的研究也逐漸廣泛。

微生物源環氧水解酶的研究引起人們的廣泛重視，主要因為它能夠高選擇性地對一系列環氧化物進行不對稱催化水解，生成具有光學活性的環氧化物和手性二醇，而且通過發酵可以大量獲得。這使得生產成本大大降低；并且它們還具有廣泛的自然來源、對環境友好等特點。這一切都使得微生物來源的環氧水解酶成為當前最有發展前途的方法之一。

目前鮮有從紅球菌屬(Rhodococcus)中分離環氧化物水解酶的報道。紅球菌屬分布范圍廣，在土壤、巖石、地下水、海底沉積物、昆蟲內臟及動物的糞便中都可存活，部分菌種是人和動物的致病菌。在工業上，紅球菌屬是優良的細菌類群，廣泛參與多種化學原料的合成與轉化；同時紅球菌屬對許多化合物也具有轉化和降解作用，可利用它生產表面活性劑及生物絮凝劑；從生物去污的角度，紅球菌屬也是非常重要的一個細菌類群。

隨著微生物來源的環氧化物水解酶的發展，各種對順式環氧化物水解酶活力測定的方法也逐漸發展起來，主要包括有：可見分光光度法、熒光法、放射化學法等，而可見光光度法需要加入偏釩酸銨溶液、硫酸溶液等顯色劑，而顯色劑的加入影響酶和底物的反應，使得結果準確度不高。另外，這些測定方法都存在酶使用量較大及繁瑣費時等缺點。因此，為了便于環氧琥珀酸水解酶生產、發酵過程的檢測和發酵條件的優化，業界急需一種方便、快速、準確測定酶活力的方法。

發明內容

本發明的目的一是獲得重組環氧琥珀酸水解酶基因，其基因來源于紅球菌菌株；二是將重組環氧琥珀酸水解酶基因表達獲得重組環氧琥珀酸水解酶質粒，體外純化表達獲得重組蛋白，該重組環氧琥珀酸水解酶能將環氧琥珀酸高效轉化為L(+)-酒石酸；三是提供一種便、快速、準確測定順式環氧化物水解酶活力的方法。

本發明第一方面是提供一種紅球菌來源的重組環氧琥珀酸水解酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本發明第二方面是提供一種重組環氧琥珀酸水解酶基因，其源自紅球菌RNA，編碼上述的重組環氧琥珀酸水解酶；相應地，其堿基數目為549bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

相應地，本發明還提供一種包含上述重組環氧琥珀酸水解酶基因的重組質粒，該重組質粒的制作方法如下：