[發明專利]一種重組環氧琥珀酸水解酶、其編碼基因、其表達及其活力的測定方法

在審

• 申請號: 201810708588.4
• 申請日: 2018-07-02
• 公開（公告）號: CN108823223A
• 公開（公告）日: 2018-11-16
• 發明（設計）人: 楊艷;溫艷珍;吳永妮;胡建水
• 申請（專利權）人: 太原科技大學
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N9/14;C12N15/70;C12N1/21;C12P7/46;C12Q1/34
• 代理公司: 中山市興華粵專利代理有限公司 44345
• 代理人: 吳劍鋒

1.一種重組環氧琥珀酸水解酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一種重組環氧琥珀酸水解酶基因，其特征在于，其源自紅球菌RNA，編碼權利要求1所述的重組環氧琥珀酸水解酶。

3.如權利要求2所述的重組環氧琥珀酸水解酶基因，其特征在于，其堿基數目為549bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

4.一種包含權利要求2或3所述的重組環氧琥珀酸水解酶基因的重組質粒，其特征在于，所述重組質粒的制作方法如下：

1)提取紅球菌中的總RNA；經NCBI檢索后設計出環氧琥珀酸水解酶的N-端和C-端引物，以紅球菌總RNA基因組為模板，進行PCR擴增，擴增出核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的重組環氧琥珀酸水解酶的編碼基因；

2)將步驟1)所得產物的編碼基因插入到PET-32M載體上，得到重組環氧琥珀酸水解酶的重組質粒。

5.如權利要求4所述的重組質粒，其特征在于，該重組質粒以大腸桿菌為宿主，表達及純化如SEQ ID NO:2所示的重組環氧琥珀酸水解酶蛋白。

6.一種對如權利要求5所述的重組質粒產生的重組環氧琥珀酸水解酶活力的測定方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)配制不同濃度的L(+)-酒石酸鈉標準溶液，測定其吸光度并繪制出吸光度標準曲線；

(2)配制0.1mol/L環氧琥珀酸鈉的底物溶液，并將其pH值調至8.0；

(3)取100mL錐形瓶，加入重組質粒產生的重組環氧琥珀酸水解酶1.0mL，再加入步驟(2)得到的底物溶液50mL；

(4)將錐形瓶放入DF-I集熱式磁力加熱攪拌器中，保持反應溫度為37℃，反應振蕩頻率為100r/min，恒溫反應一定時間，在0min、1min、2min、3min、4min、5min、10min、15min、20min、25min、30min、40min、50min、60min、120min的時間點從錐形瓶中分別取出2-3mL反應液；

(5)于最大吸收波長處分別測定步驟(4)所得的反應液的吸光度；

(6)根據步驟(1)的吸光度標準曲線以及步驟(5)所得的吸光度數據，計算推導出重組環氧琥珀酸鈉水解酶的酶促反應速率，進而繪制出重組環氧琥珀酸鈉水解酶的酶促反應動力學曲線。

7.根據權利要求6所述的測定方法，其特征在于，所述步驟(1)包括以下步驟：

①配制不同濃度的L(+)-酒石酸鈉標準溶液，以蒸餾水為參比，于紫外光波長190-300nm范圍內，測定吸光度，并確定最大吸收波長范圍及最大吸收波長；其中，L(+)-酒石酸鈉標準溶液的紫外光最大吸收波長為231nm；

②于最大吸收波長處分別測定不同濃度的L(+)-酒石酸鈉標準溶液的吸光度，以濃度為橫坐標，相應的吸光度為縱坐標繪制出吸光度標準曲線。

8.一種對如權利要求5所述的重組質粒產生的重組環氧琥珀酸水解酶活力的測定方法，其特征在于，包括以下步驟：

(a)配制不同體積的質量濃度為2500μg/mL的酒石酸標準工作溶液，將其分別注入高效液相色譜儀中，測定相應的峰高或峰面積，并繪制標準曲線；

(b)吸取10mmol/L的環氧琥珀酸鈉的底物溶液30mL加入到燒杯中，并將其pH值調至8.0；

(c)在步驟(b)的燒杯中加入重組環氧琥珀酸水解酶5mL，于37℃保溫30min后取上清液注入高效液相色譜儀中，測出標準保留時間曲線，確定產物的保留時間，并繪制相應的色譜圖。