[發明專利]一種高產衣康酸解脂耶氏酵母工程菌株及其構建方法、發酵工藝與應用

在審

• 申請號: 201810708265.5
• 申請日: 2018-07-02
• 公開（公告）號: CN108795789A
• 公開（公告）日: 2018-11-13
• 發明（設計）人: 劉建軍;趙晨;趙祥穎;張家祥;張立鶴;田延軍;賀強之
• 申請（專利權）人: 山東省食品發酵工業研究設計院
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12P7/44;C12R1/645
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 董潔

本發明公開了一株高產衣康酸解脂耶氏酵母工程菌株及其構建方法、發酵工藝與應用，該工程菌株為表達來自曲霉菌株HAT418的cadA和mttA基因的解脂耶氏酵母。本發明通過CRISPR/Cas9基因編輯技術和非同源重組技術實現了衣康酸高產土曲霉的順烏頭酸脫羧酶基因(cadA)和線粒體順烏頭酸轉運蛋白基因(mttA)在解脂耶氏酵母中的高表達，篩選到的解脂耶氏酵母工程菌株發酵衣康酸產量高、純度高。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種高產衣康酸解脂耶氏酵母工程菌株及其構建方法、發酵工藝與應用。

背景技術

衣康酸又稱甲叉丁二酸、亞甲基琥珀酸，由于分子結構中含有兩個羧基團、一個亞甲基、一個雙鍵，決定了其具有十分活潑的化學性質，可以自身聚合，也可以和其他分子發生加成、聚合等化學反應，是一種應用前景十分廣闊的化學合成中間體，廣泛應用于化工、醫藥、造紙、印刷等領域(Willke et al.,2001；Okabe et al.,2009)，2004年被美國能源局評為12種生物基平臺化合物之一(Werpy et al.,2004)。由于環保壓力導致生物基材料需求的不斷增加，到2020年衣康酸市場有望突破2.16億美元(Juliana Cunha da Cruz etal,2018)。

當前，衣康酸主要采用土曲霉菌株發酵法生產(Kuenz et al.,2012；AntjeHevekerl et al.,2014)。研究推測土曲霉中的衣康酸合成途徑為：衣康酸合成的前體為TCA循化中間產物順烏頭酸，順烏頭酸是由順烏頭酸酶ACO(acoA)催化檸檬酸合成的。在線粒體中的合成的順烏頭酸由線粒體轉運蛋白MTT(mttA)轉運至細胞胞質中，之后在順烏頭酸脫羧酶CAD(cadA)作用下脫羧生成衣康酸，然后可能由定位于細胞膜上的非特異性轉運蛋白MFS(mfsA)轉運出胞外(圖1)(An Li et al.,2011；Okabe et al.,2009；Klement andBüchs,2013,Shin Kanamasa et al.,2008)。相比酵母，土曲霉生長相對緩慢，且對剪切力的耐受性較差，同時缺乏基因工程工具，限制了土曲霉通過基因工程手段進一步改造成優良工程菌(Peiching Chang et al.,2017)。為此，研究人員開始嘗試采用黑曲霉、大腸桿菌(-Johannes harder et al.,2016)、谷氨酸棒桿菌(Otten A.et al.,2015)、釀酒酵母(John Blazeck et al.,2014)等宿主通過基因工程手段成功構建可以積累衣康酸的工程菌株。與以上這些菌種相比，解脂耶氏酵母生長迅速，耐剪切的能力強，且當前耶氏酵母的基因操作工具也逐漸增多，使其成為更具優勢的具有工業化潛力的代謝工程平臺菌株(F.A.G.et al.,2014；Rywin’Ska,A.et al.,2013,Schwartz et al.,2016)，目前，耶氏酵母已經作為宿主菌用于琥珀酸、β-胡蘿卜素等工程菌株的構建，并取得很好結果。2015年Blazeck等人首次嘗試在耶氏酵母中胞質中過表達cadA和acoA基因，篩選到可以積累衣康酸的工程菌株，優化后工程菌株衣康酸產量達到4.6g/L，相比工業生產中土曲霉80g/L衣康酸產量還有較大差距。

發明內容

針對現有技術，本發明提供一株高產衣康酸的解脂耶氏酵母基因工程菌株及其構建方法。同時，提供該工程菌株用于衣康酸發酵工藝。

為實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下：

本發明的第一個方面，提供一株高產衣康酸解脂耶氏酵母工程菌株，其特點是：該工程菌株是表達了來自衣康酸高產土曲霉菌株HAT418的cadA和mttA基因的解脂耶氏酵母。

本發明的第二個方面，提供所述高產衣康酸解脂耶氏酵母工程菌株的構建方法，該方法包括：

將cadA和mttA與表達載體連接，制備得到含有目的基因的表達載體，再將表達載體轉化進入解脂耶氏酵母細胞內，篩選獲得攜帶cadA和mttA基因并能夠進行表達的解脂耶氏酵母工程菌株。