[發明專利]一種高產衣康酸解脂耶氏酵母工程菌株及其構建方法、發酵工藝與應用

在審

• 申請號: 201810708265.5
• 申請日: 2018-07-02
• 公開（公告）號: CN108795789A
• 公開（公告）日: 2018-11-13
• 發明（設計）人: 劉建軍;趙晨;趙祥穎;張家祥;張立鶴;田延軍;賀強之
• 申請（專利權）人: 山東省食品發酵工業研究設計院
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12P7/44;C12R1/645
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 董潔

1.一株高產衣康酸解脂耶氏酵母工程菌株，其特征是：該工程菌株為表達來自曲霉菌株HAT418的順烏頭酸脫羧酶基因(cadA)和順烏頭酸轉運蛋白基因(mttA)的解脂耶氏酵母。

2.如權利要求1所述的工程菌株，其特征是：cadA基因的核酸序列如SEQ IDNo.1所示，mttA基因的核酸序列如SEQ IDNo.2所示。

3.如權利要求1所述的工程菌株，其特征是：采用整合到基因組或采用表達質粒載體的方式進行表達；

優選的，采用CRISPR/Cas9基因編輯技術將cadA基因整合到解脂耶氏酵母基因組中進行表達；

采用非同源重組的方式將mttA基因整合到解脂耶氏酵母基因組進行表達。

4.如權利要求1所述的工程菌株，其特征是：所述解脂耶氏酵母親株為解脂耶氏酵母株Po1f菌株。

5.權利要求1～4中任一項中所述的高產衣康酸解脂耶氏酵母工程菌株的構建方法，其特征是，包括以下步驟：

將cadA和mttA基因與表達載體連接，制備得到含有目的基因的表達載體，再將該表達載體轉化進入解脂耶氏酵母，通過CRISPR/Cas9基因編輯技術將cadA整合到基因組制定位點，通過非同源重組將mttA整合到基因組非特定位點，即獲得高產衣康酸解脂耶氏酵母工程菌株。

6.如權利要求5所述的構建方法，其特征是，該構建方法具體包括以下步驟：

(1)cadA和mttA目的基因的制備與擴增；

(2)目的基因與表達載體的鏈接，制備得到含有目的基因的表達載體；

(3)將含有各目的基因的表達載體轉化解脂耶氏酵母，篩選目的基因整合到基因組中并能夠產生衣康酸的解脂耶氏酵母工程菌株。

7.如權利要求6所述的構建方法，其特征是：所述表達載體為質粒載體；

優選的，首先采用CRISPR技術將cadA基因轉入解脂耶氏酵母Po1f菌株，得到PC-7菌株；然后將mttA基因轉入PC-7菌株，相關表達載體是pSFY-LEU-mttA質粒，得到PC-MTT菌株，即為高產衣康酸解脂耶氏酵母工程菌株。

8.權利要求1～4中任一項所述的高產衣康酸解脂耶氏酵母工程菌株在制備衣康酸中的應用。

9.一種衣康酸的發酵生產方法，其特征是：該方法包括采用權利要求1～4中任一項所述的高產衣康酸解脂耶氏酵母工程菌株進行發酵的步驟。

10.如權利要求9所述的生產方法，其特征是：該生產方法具體包括以下步驟：

首先將工程菌株接種于YPD液體培養基中，在28～30℃，180～300rpm條件下培養16～20h，之后接種到分批補料發酵培養基中，使其初始OD600＝1.0～1.2，通風量為0.5～1.5v/(v·min)，攪拌轉速250-350rpm，罐壓0.06～0.08Mpa，發酵溫度為28～30℃，當葡萄糖濃度小于20g/L時，進行葡萄糖批次補料，使培養基中葡萄糖濃度為40～60g/L；所述分批補料發酵培養基中氮源含量為1～3(w/w)％，酵母粉與蛋白胨的質量比例為1:2～2:1。