[發明專利]實時熒光定量PCR檢測外源GhCAD6基因在棉花纖維中表達量的方法

在審

• 申請號: 201810706577.2
• 申請日: 2018-06-20
• 公開（公告）號: CN110616250A
• 公開（公告）日: 2019-12-27
• 發明（設計）人: 胡文冉;蘇秀娟;李曉榮;周小云;楊洋;李波;范玲;樊國全;劉建喜;鄧曉娟
• 申請（專利權）人: 新疆農業科學院核技術生物技術研究所(新疆維吾爾自治區生物技術研究中心);新疆農業大學
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種采用實時熒光定量PCR檢測外源GhCAD6基因在棉花纖維中的表達量的方法，首先采用熱硼酸?蛋白酶K法提取出棉花纖維的RNA，反轉錄成cDNA，利用特異性引物和內參基因，在特定的反應條件和反應程序下進行熒光RT?PCR，檢測外源GhCAD6基因在不同發育階段棉纖維中的表達量，該方法自動收集熒光信號，避免了肉眼判斷的主觀性，提高了實驗的靈敏度，保證了結果的可靠性和重復性，免除了常規PCR中的電泳、定量掃描等后續繁瑣步驟，大大縮短了實驗時間；本發明中棉花GhCAD6基因實時熒光RT?PCR檢測方法的建立，為研究棉花GhCAD6基因表達調控機理及利用其改良棉花纖維品質的研究奠定了基礎。

一、技術領域

本發明涉及生物技術領域，涉及一種轉基因棉花外源基因表達量的分析方法，具體為一種實時熒光定量PCR技術檢測外源GhCAD6基因在棉花纖維中表達量的方法。

二、背景技術

新中國成立以來，我國棉花(G.hirsutum)產量和品質都得到了大幅度的提高。但還存在著纖維比強度偏低及纖維品質諸指標搭配不合理等問題，難以滿足國內外市場和紡織工業的多種需求(唐淑榮等，2015)。新疆作為我國最大的優質棉生產基地也存在著同樣的問題，嚴重影響著我國棉花在國際上的競爭力(許乃銀等，2017)。由于缺乏優異種質和親本材料，所以在常規育種方面棉花纖維品質改良效果并不明顯。目前棉花纖維改良的途徑已從常規育種轉向常規育種與生物技術育種相結合，其中轉基因研究是棉纖維品質改良的一個重要方面。

“十一五”期間國家根據農作物生產的實際需求，啟動了轉基因重大專項。本項目組范玲研究員主持了轉基因生物新品種培育重大專項，在項目開展的過程中，應用自主研究成果，根據肉桂酸脫氫酶(Cinnamyl Alcohol Dehydrogenase，CAD)是植物細胞壁交聯結構形成的重要功能基因，從發育的棉花纖維中克隆出調節細胞壁交聯結構形成的相關主效基因GhCAD6(GenBank序列號為：EU281305.1)。CAD是苯丙烷代謝途徑上一個重要的基因家族，在形成細胞壁交聯結構、細胞壁的延伸停止、次生壁發育起始及次生壁的發育中起重要作用。ChCAD6基因是CAD基因家族中重要的功能基因，該基因的表達量與棉花纖維的次生壁發育同步。項目組將ChCAD6基因利用農桿菌介導法轉化棉花受體，獲得了多個纖維長度較受體增加1.17-3.21mm(4.22-11.58％)，比強度較受體增加3.2-7.1cN/tex(12.26-27.20％)的轉基因株系，且轉基因株系經過田間多代種植表現穩定遺傳。

外源ChCAD6基因轉化棉花受體后獲得的轉基因后代纖維長度和比強度都得到明顯改良，但外源ChCAD6基因在轉基因后代植株纖維中尤其是在棉纖維次生壁發育過程中的表達情況還缺乏系統研究。因此，為研究外源GhCAD6改良棉花纖維品質的機理，非常有必要通過研究GhCAD6基因在轉基因后代棉花纖維次生壁發育過程中的表達量。

基因表達的定量檢測方法很多，主要從蛋白表達水平、mRNA表達水平及外源DNA幾個方面入手，包括酶聯免疫吸附測定(ELISA)、蛋白雜交(Western Blotting)、高效液相色譜(HPLC)、Southern雜交、Northern雜交、生物芯片技術(Biochips)及聚合酶鏈式反應(PCR)技術、半定量RT-PCR、實時熒光定量PCR(Real-Time PCR)等等。各個檢測方法在檢測基因表達量時各有其優缺點，其中實時熒光定量PCR技術具有特異性高、靈敏度高、可定量、有效解決PCR污染問題及自動化程度高等優點，保證了結果的可靠性和可重復性，已廣泛應用于分子生物學和醫學等研究領域。但對于棉花纖維富含酚類化合物、多糖和次生代謝產物，內源RNA酶活性高等特點，適宜的棉花纖維RNA提取方法、合適的引物及內參基因是保證實時熒光定量PCR實施的關鍵，合適的實時熒光定量PCR反應條件也是實驗實施必不可少的內容之一。因此，對于外源GhCAD6基因通過農桿菌介導法轉入棉花后，還未見有利用實時熒光定量PCR檢測其在不同發育階段棉花纖維中表達量的報道。

三、發明內容