[發(fā)明專利]實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)外源GhCAD6基因在棉花纖維中表達(dá)量的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810706577.2
• 申請(qǐng)日: 2018-06-20
• 公開（公告）號(hào): CN110616250A
• 公開（公告）日: 2019-12-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡文冉;蘇秀娟;李曉榮;周小云;楊洋;李波;范玲;樊國(guó)全;劉建喜;鄧曉娟
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院核技術(shù)生物技術(shù)研究所(新疆維吾爾自治區(qū)生物技術(shù)研究中心);新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6851
• 分類號(hào): C12Q1/6851
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)外源GhCAD6基因在棉花纖維中表達(dá)量的方法，其特征是采用符合熒光PCR反應(yīng)特點(diǎn)的目標(biāo)基因及內(nèi)參基因的特異性上、下游引物，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)目標(biāo)基因在不同發(fā)育階段棉花纖維中的表達(dá)量，其具體步驟為：

a、棉花纖維總RNA提取：采用熱硼酸-蛋白酶K法提取不同發(fā)育階段棉花纖維的RNA；

b、cDNA第一鏈合成：以棉花RNA為模板合成cDNA第一鏈，反應(yīng)體系為20μL；

c、實(shí)時(shí)熒光PCR：以上述合成的cDNA第一鏈為模板，利用如下引物作為特異性引物，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行管，擴(kuò)增后所得3個(gè)平行管的Ct值取平均數(shù)；

符合熒光PCR反應(yīng)特點(diǎn)的該目的基因GhCAD6序列特異性上下游引物：

GhCAD6-F：5’-GTTCCTGGGCATGAAGTGGT-3’

GhCAD6-R：5’-TGCAACATCCAACAAGACAACC-3’

以及作為內(nèi)參基因的棉花GhUBQ7基因特異性上下游引物：

GhUBQ7-F：5’-AGAGGTCGAGTCTTCGGACA-3’

GhUBQ7-R：5’-GCTTGATCTTCTTGGGCTTG-3’

其熒光定量定量PCR的反應(yīng)體系為：總體積為20μL，內(nèi)含Select Master Mix(2X)10μL，F(xiàn)orward primer(10μM)0.40μL，Reverse primer(10μM)0.40μL，cDNA 1μL，RNase-free水補(bǔ)足到20μL；

實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：UDG Activation AmpliTaq DNA，50℃，2min；Polymerase，UP Activation，95℃，2min；PCR反應(yīng)40cycles，95℃，15sec，60℃，1min；

d、不同發(fā)育階段棉花纖維中GhCAD6基因的相對(duì)表達(dá)量計(jì)算：實(shí)時(shí)熒光PCR完成后，根據(jù)Ct值計(jì)算棉花纖維中GhCAD6基因各時(shí)間段下的ΔCt、2^-ΔΔCt值，計(jì)算方式如下：

ΔCt＝GhCAD6(mean Ct)-GhUBQ7(相同發(fā)育階段mean Ct)

ΔΔCt＝ΔCt(轉(zhuǎn)GhCAD6基因后代樣品)-ΔCt(相同發(fā)育階段對(duì)照樣品)

以2^-ΔΔCt數(shù)值表示外源GhCAD6基因相對(duì)于對(duì)照非轉(zhuǎn)基因棉花GhCAD6基因的表達(dá)量。