[發明專利]一種運用RNAi有效防治鱗翅目害蟲的方法

在審

• 申請號: 201810705708.5
• 申請日: 2018-07-02
• 公開（公告）號: CN108795940A
• 公開（公告）日: 2018-11-13
• 發明（設計）人: 開振鵬;殷玥;陳珊珊
• 申請（專利權）人: 上海應用技術大學;上海市農業科學院
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/10;A01N57/16;A01P7/04
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司 31253
• 代理人: 楊軍

本發明公開了一種運用RNAi有效防治鱗翅目害蟲的方法。該方法通過飼喂的方式將針對法尼醇脫氫酶FOLD、保幼激素甲基轉移酶JHAMT、保幼激素環氧酶CYP15C1相關基因的雙鏈RNA(即dsRNA)導入到幼蟲體內，實現防治鱗翅目害蟲的目的；本發明方法用于防治鱗翅目害蟲，防治特異性強，防治效果持久，安全，對哺乳動物等無害。

技術領域

本發明涉及生物防治技術領域，具體的說，涉及一種運用RNAi有效防治鱗翅目害蟲的方法。

背景技術

鱗翅目昆蟲，主要包括蛾、蝶兩類昆蟲。全世界已知約20萬種，中國已知約8000余種。其中蛾類6000種，蝶類2000種。同時也是農、林害蟲最多的一個目。絕大多數種類的幼蟲為害各類栽培植物，體形較大者常食盡植物葉片或鉆蛀枝干。體形較小者往往卷葉、綴葉、結鞘、吐絲結網或鉆入植物組織取食為害。鱗翅目幼蟲絕大多數為陸生，多為植食性，是一種廣泛分布于全球的害蟲。目前主要通過物理誘殺和化學殺蟲劑進行防治，效果均有限，且殺蟲劑的施用很可能帶來生物安全性問題和抗性的產生，亟需發現新方法。

RNA干擾技術近年來發展迅速，利用dsRNA對基因表達水平進行下調很可能成為害蟲防治的新手段。RNA干擾的成功與否主要取決于靶基因的選擇，目前對昆蟲的研究主要集中在神經、代謝以及生殖發育相關酶類，對于保幼激素合成的研究還較少。保幼激素作為調節昆蟲生長發育的重要激素，其生物合成中涉及的酶類具有作為RNAi靶標的潛力。

發明內容

本發明的目的是針對上述現狀，旨在提供一種運用RNAi有效防治鱗翅目害蟲的方法，其以保幼激素生物合成相關酶基因作為RNAi靶標，抑制害蟲保幼激素的合成，調控鱗翅目害蟲生長發育。

本發明的實現方式為，用RNAi有效防治鱗翅目害蟲的方法，利用飼喂的方式將針對法尼醇脫氫酶FOLD、保幼激素甲基轉移酶JHAMT、保幼激素環氧酶CYP15C1相關基因的雙鏈RNA導入到鱗翅目害蟲體內，抑制其相關酶的表達，抑制保幼激素合成，導致幼蟲的死亡，達到防治鱗翅目害蟲的目的。本發明的技術方案具體介紹如下。

一種運用RNAi有效防治鱗翅目害蟲的方法，通過飼喂的方式將針對法尼醇脫氫酶FOLD、保幼激素甲基轉移酶JHAMT、保幼激素環氧酶CYP15C1相關基因的雙鏈RNA導入到幼蟲體內，實現防治鱗翅目害蟲的目的；其中：針對法尼醇脫氫酶FOLD、保幼激素甲基轉移酶JHAMT、保幼激素環氧酶CYP15C1相關基因的雙鏈RNA的合成步驟如下：

(1)提取總RNA，反轉錄全部mRNA為cDNA，根據已知的鱗翅目害蟲的FOLD、JHAMT和CYP15C1基因設計特異性引物，引物均添加T7啟動子，PCR擴增特異片段，利用瓊脂糖凝膠電泳對引物進行驗證；

(2)以咽側體cDNA作為擴增的模板，這些碎片再一次進行克隆放大，dsRNA(法尼醇脫氫酶FOLD、保幼激素甲基轉移酶JHAMT、保幼激素環氧酶CYP15C1基因的雙鏈RNA)的合成與純化采用MEGA script RNAi試劑盒，擴增產物進行消化反應以去除混有的模板DNA和單鏈RNA；

(3)解剖鱗翅目害蟲的幼蟲，取出咽側體，進行RNA提取，完成后續反轉錄步驟，采用q-RT-PCR檢測表達水平，實現dsRNA的體外培養。

本發明中，步驟(1)中，擴增FOLD基因片段的上游引物的序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物的序列如SEQ ID NO:2所示；擴增JHAMT基因片段的上游引物的序列如SEQ ID NO:3所示，下游引物的序列如SEQ ID NO:4所示；擴增CYP15C1基因片段的上游引物的序列如SEQ ID NO:5所示，下游引物的序列如SEQ ID NO:6所示。

本發明中，飼喂時，法尼醇脫氫酶FOLD、保幼激素甲基轉移酶JHAMT、保幼激素環氧酶CYP15C1基因的雙鏈RNA和食物總重量的投料比分別在2.5～3.5mg/g之間。