[發明專利]一種運用RNAi有效防治鱗翅目害蟲的方法

在審

• 申請號: 201810705708.5
• 申請日: 2018-07-02
• 公開（公告）號: CN108795940A
• 公開（公告）日: 2018-11-13
• 發明（設計）人: 開振鵬;殷玥;陳珊珊
• 申請（專利權）人: 上海應用技術大學;上海市農業科學院
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/10;A01N57/16;A01P7/04
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司 31253
• 代理人: 楊軍

1.一種運用RNAi有效防治鱗翅目害蟲的方法，其特征在于，通過飼喂的方式將針對法尼醇脫氫酶FOLD、保幼激素甲基轉移酶JHAMT、保幼激素環氧酶CYP15C1相關基因的雙鏈RNA導入到幼蟲體內，實現防治鱗翅目害蟲的目的；其中：法尼醇脫氫酶FOLD、保幼激素甲基轉移酶JHAMT、保幼激素環氧酶CYP15C1相關基因的雙鏈RNA的合成步驟如下：

(1)提取總RNA，反轉錄全部mRNA為cDNA，根據已知的鱗翅目害蟲的FOLD、JHAMT和CYP15C1基因設計特異性引物，引物均添加T7啟動子，PCR擴增特異片段，利用瓊脂糖凝膠電泳對引物進行驗證；

(2)以咽側體cDNA作為擴增的模板，這些碎片再一次進行克隆放大，dsRNA的合成與純化采用MEGA script RNAi試劑盒，擴增產物進行消化反應以去除混有的模板DNA和單鏈RNA；

(3)解剖鱗翅目害蟲的幼蟲，取出咽側體，進行RNA提取，完成后續反轉錄步驟，采用q-RT-PCR檢測表達水平，實現dsRNA的體外培養。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，擴增FOLD基因片段的上游引物的序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物的序列如SEQ ID NO:2所示；擴增JHAMT基因片段的上游引物的序列如SEQ ID NO:3所示，下游引物的序列如SEQ ID NO:4所示；擴增CYP15C1基因片段的上游引物的序列如SEQ ID NO:5所示，下游引物的序列如SEQ ID NO:6所示。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，飼喂時，法尼醇脫氫酶FOLD、保幼激素甲基轉移酶JHAMT、保幼激素環氧酶CYP15C1基因的雙鏈RNA和食物總重量的投料比分別在2.5～3.5mg/g之間。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，鱗翅目害蟲包括煙草天蛾和棉鈴蟲。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，針對法尼醇脫氫酶FOLD、保幼激素甲基轉移酶JHAMT、保幼激素環氧酶CYP15C1相關基因的雙鏈RNA，即dsFOLD、dsJHAMT、dsCYP15C1和dsGFP的序列分別如SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:12所示。