[發(fā)明專(zhuān)利]用于檢測(cè)沙門(mén)氏菌的RPA引物、探針及檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810697598.2
• 申請(qǐng)日: 2018-06-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108588251A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-09-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳佳平;陳晶;黃靜敏;陳血建;郭正洋;肖承榮;蔡琳;施棣欣;張永鑫;馬芳草;楊國(guó)武
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 深圳市計(jì)量質(zhì)量檢測(cè)研究院（國(guó)家高新技術(shù)計(jì)量站;國(guó)家數(shù)字電子產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心）
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/689
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/689;C12Q1/04;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/42
• 代理公司: 深圳市科吉華烽知識(shí)產(chǎn)權(quán)事務(wù)所(普通合伙) 44248
• 代理人: 胡玉

本發(fā)明提供用于檢測(cè)沙門(mén)氏菌的RPA引物、探針及檢測(cè)方法。其引物序列如下：針對(duì)iroB基因：上游引物SEQ ID No.1:5’?GGAATGTCATACTTAGCGGGTTTGACACGAGC?3’；下游引物SEQ ID No.2:5’?GGTGGTATTTGACGCTGGCGGTGCAAACCT?3’。本發(fā)明將RPA技術(shù)與熒光檢測(cè)相結(jié)合，可以快速準(zhǔn)確的檢測(cè)沙門(mén)氏菌。該方法可從常見(jiàn)致病菌中特異性檢測(cè)到沙門(mén)氏菌，對(duì)沙門(mén)氏菌的快速檢測(cè)提供了技術(shù)支持，同時(shí)可以免除昂貴儀器的投入，便于在基層推廣使用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及用于檢測(cè)沙門(mén)氏菌的引物、探針及檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

沙門(mén)氏菌是最常見(jiàn)的食源性致病菌之一，作為一種人畜共患病的病原菌，它每年會(huì)在全球廣泛流行，導(dǎo)致病人出現(xiàn)腸胃炎和傷寒等癥狀，并給全世界帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，開(kāi)發(fā)沙門(mén)氏菌的快速檢測(cè)方法對(duì)保障社會(huì)的食品安全及人民身體健康具有重要的意義。

目前沙門(mén)氏菌的檢測(cè)方法傳統(tǒng)培養(yǎng)方法、基于免疫學(xué)原理的方法以及基于分子生物學(xué)的方法。傳統(tǒng)培養(yǎng)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備的要求不高，但是檢測(cè)周期較長(zhǎng)，通常長(zhǎng)達(dá)五天以上，并且該方法對(duì)檢測(cè)人員的操作要求較高。而免疫學(xué)檢測(cè)方法雖然靈敏度高，但是易受非特異反應(yīng)干擾。基于分子生物學(xué)的方法雖然可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)菌的快速檢測(cè)，但是它往往需要依賴昂貴的設(shè)備，例如熒光PCR法需要配套價(jià)格高達(dá)數(shù)十萬(wàn)元的熒光PCR儀。這些方法均不利于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(recombinase polymerase amplification,RPA)是2006年由英國(guó)研究人員研發(fā)的一種新型的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，其原理是在恒溫下，重組酶與寡核苷酸引物形成復(fù)合體，酶促使引物定位到DNA雙鏈模板的同源靶序列上，解鏈模板DNA，引物與模板單鏈結(jié)合并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互補(bǔ)鏈，同時(shí)單鏈DNA結(jié)合蛋白與另外一條模板單鏈結(jié)合。該方法的主要特點(diǎn)在等溫條件下即可高效、快速、高特異、高靈敏的擴(kuò)增靶基因。目前RPA技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用到病毒、細(xì)菌、支原體、寄生蟲(chóng)等的快速檢測(cè)中，然而目前基于沙門(mén)氏菌iroB基因的引物和探針及檢測(cè)方法并沒(méi)有被應(yīng)用于沙門(mén)氏菌的檢測(cè)應(yīng)用中。

目前多種沙門(mén)氏菌的基因被作為靶基因應(yīng)用于沙門(mén)氏菌的檢測(cè)中，但是大多數(shù)靶基因的特異性并不理想。iroB基因是一種特異性良好的沙門(mén)氏菌種特異性靶基因，針對(duì)該基因建立的PCR法可以特異檢測(cè)出各血清型的沙門(mén)氏菌，并且該方法對(duì)其他腸道微生物的檢測(cè)結(jié)果全都為陰性。因此基于沙門(mén)氏菌iroB基因的RPA引物和探針及RPA檢測(cè)方法在對(duì)沙門(mén)氏菌的檢測(cè)中將有著優(yōu)良的特異性。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決以上技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)沙門(mén)氏菌的RPA引物，其引物序列如下：針對(duì)iroB基因：

上游引物SEQ ID No.1:5’-GGAATGTCATACTTAGCGGGTTTGACACGAGC-3’

下游引物SEQ ID No.2:5’-GGTGGTATTTGACGCTGGCGGTGCAAACCT-3’。

優(yōu)選的，采用上游引物、下游引物中的至少一種，或選自權(quán)利要求1所述的引物中的上游引物、下游引物序列或上游引物、下游引物序列的互補(bǔ)鏈序列中單條序列同源性為50％及以上的堿基序列。

本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)沙門(mén)氏菌的RPA探針，其序列如下：

針對(duì)iroB基因的探針：

SEQ ID No.3:5’-CGCTGAAGAATGAGAAGTTCCCCAAAATGTGGAAACATTAAATC-3’。