[發(fā)明專利]檢測ATP7B基因突變的檢測體系及其試劑盒

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810696688.X
• 申請日: 2018-06-29
• 公開（公告）號: CN108676859A
• 公開（公告）日: 2018-10-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王明;趙國玲;洪專
• 申請（專利權(quán)）人: 上海賽安生物醫(yī)藥科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12Q1/6851
• 代理公司: 上海海頌知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31258
• 代理人: 任益

本發(fā)明涉及一種檢測ATP7B基因突變的檢測體系及其試劑盒，包括數(shù)字PCR預(yù)混液和引物探針混合液；引物探針混合液包括用于檢測第8號外顯子c.2333 G>T位點的上下游引物A和肽核酸探針A，用于檢測第13號外顯子c.2975 C>T位點的上下游引物B和肽核酸探針B；所述肽核酸探針A的核苷酸序列與ATP7B基因c.2333突變型位點完全互補，所述肽核酸探針B的核苷酸序列與ATP7B基因c.2975突變型位點完全互補；所述肽核酸探針的5’端連接有由4個氨基酸構(gòu)成的強螯合基團。本發(fā)明的檢測ATP7B基因突變的檢測體系及其試劑盒靈敏度和特異性高，樣品需求量少，可以快速便捷準(zhǔn)確地進行PCR定量檢測。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種檢測ATP7B基因突變的檢測產(chǎn)品，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

Wilson病(WD)，亦稱肝豆?fàn)畈∽儯且环N與銅代謝障礙相關(guān)的常染色體隱性遺傳病。WD起病時通常有一段無癥狀期，期間銅在肝臟中積累，從而導(dǎo)致亞臨床肝炎和神經(jīng)精神癥狀的發(fā)展。ATP7B基因是目前唯一已知的WD相關(guān)基因，ATP7B基因全長約80kb，含22個外顯子。ATP7B是一個膜相關(guān)的金屬轉(zhuǎn)運ATP酶，能利用ATP提供的能量使天冬氨酸殘基磷酸化的同時實現(xiàn)銅離子轉(zhuǎn)運，參與銅跨膜轉(zhuǎn)運過程。其生理功能是使銅離子活化、使金屬銅結(jié)合到銅藍(lán)蛋白中，維持正常銅代謝。當(dāng)前已報道的ATP7B基因突變已有500余種。對我國WD患者的研究表明，發(fā)生在8、12、13和16外顯子的基因突變占70％以上。其中8號外顯子Arg778Leu突變頻率高達(dá)46.15％，證實了在我國Arg778Leu是基因突變熱點，而13號外顯子Pro992Leu突變占15.38％，突變頻率位居第二。

外周血細(xì)胞游離DNA是來自正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞死亡后釋放的核酸片段總稱。由于其再體內(nèi)的半衰期較短且細(xì)胞釋放的核酸會進入外周血，因此cfDNA較之于組織標(biāo)本更能實時全面地反映患者體內(nèi)的腫瘤情況。使用靈敏度較低的常規(guī)方法檢測只能發(fā)現(xiàn)小部分患者在接受特定治療前的腫瘤變異，采用高靈敏度法(如dPCR)檢測則可以發(fā)現(xiàn)較高比例的攜帶突變型患者。多重數(shù)字PCR由于靈敏度等方面的優(yōu)勢，通過單分子擴增把低豐度的基因信號從復(fù)雜背景中分辨出來，可用于疾病或病毒的早期診斷或療效監(jiān)測。與常規(guī)的ARMs方法相比，多重數(shù)字PCR在檢測血漿cfDNA時靈敏度明顯優(yōu)于ARMs法。

PNA(peptide nucleic acid)中文名稱肽核酸，是一種全新的人工合成DNA類似物，它與DNA分子的差異在于戊糖磷酸二酯鍵骨架被中性肽鏈酰胺2-氨基乙基甘氨酸鍵取代，其他結(jié)構(gòu)與DNA一致。基于PNA的多重數(shù)字PCR技術(shù)主要依賴PNA探針的兩個重要特性：第一，PNA只能與完全配對的互補DNA鏈雜交，只要有單一堿基發(fā)生錯配，PNA就不能與互補的DNA鏈結(jié)合；第二，PNA寡聚體不能被DNA聚合酶識別，從而不會成為PCR擴增的引物。相反，它作為特定序列選擇工具，可以阻止想應(yīng)的PCR擴增。一旦模板中的目的基因發(fā)生突變并因此出現(xiàn)錯配，DNA/PNA雙鏈結(jié)合松動，DNA寡聚體模板鏈就可以正常延伸，作為PCR引物，使發(fā)生突變的樣本在多重數(shù)字PCR中得到陽性擴增產(chǎn)物，而野生型基因則不會擴增。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種包含由強螯合基團修飾的肽核酸探針，靈敏度和特異性高，模板DNA需求量少，可以快速便捷地進行精準(zhǔn)定量PCR檢測的ATP7B基因突變檢測檢測體系及其試劑盒。

本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題提出的一種技術(shù)方案是：一種檢測ATP7B基因突變的檢測體系，包括數(shù)字PCR預(yù)混液和引物探針混合液；

所述引物探針混合液包括用于檢測第8號外顯子c.2333G>T位點的上下游引物A和肽核酸探針A，以及用于檢測第13號外顯子c.2975C>T位點的上下游引物B和肽核酸探針B；