[發明專利]雙熒光素酶報告基因表達載體pFireRluc的制備方法及其應用

在審

• 申請號: 201810695795.0
• 申請日: 2018-06-29
• 公開（公告）號: CN108728467A
• 公開（公告）日: 2018-11-02
• 發明（設計）人: 馮龍;趙國強;路武豪;王黎;王媛媛;孫倩倩;吳建博;李志慧;史占江
• 申請（專利權）人: 河南中醫藥大學
• 主分類號: C12N15/65
• 分類號: C12N15/65;C12N15/66;C12N15/70;C12Q1/02
• 代理公司: 鄭州天陽專利事務所(普通合伙) 41113
• 代理人: 聶孟民

1.一種雙熒光素酶報告基因表達載體pFireRluc的制備方法，其特征在于，以pmirGLO載體為模板，以R1/R2為引物進行擴增獲得Rluc序列片段，該序列兩端加上SalI酶切位點，以Sal I單酶切pGL4.10載體，將Rluc序列片段插入pGL4.10載體中，構建重組的pFireRluc雙熒光素酶報告基因載體，具體方法包括以下步驟：

（1）、設計Rluc引物：

根據pmirGLO質粒中的Rluc表達單元DNA序列設計引物R1、R2：

（2）、PCR擴增：

以pmirGLO載體為模板，以R1、R2為引物進行PCR擴增，獲得Rluc表達單元；

（3）、產物電泳：

將PCR擴增產物與10×溴酚藍加樣緩沖液混合，進行瓊脂糖凝膠電泳，用DNAMakrer2000判斷擴增片段大小，用凝膠分析系統照相；

（4）、對電泳質粒提取、純化，方法是：在紫外光照射下，將含有目的基因片段的瓊脂糖凝膠快速切下，計算凝膠塊的重量；凝膠塊中加入Buffer DE-A，融化；加入一半體積的緩沖液Buffer DE-B，混勻成混合液；將混合液裝柱離心，棄濾液，反復4次，裝入Eppendorf管洗脫DNA，離心，溫浴，電泳，驗證回收的目的片段長度，得Rluc PCR擴增產物；

（5）、制備DH5α感受態細菌：用接種環挑取LB固體培養基上的單個DH5α菌落，將其接種于LB液體培養基中，振蕩過夜，培養，將菌液移至聚丙烯管中，放置冰水混合物中培養，冷卻，離心，回收細菌，重懸，離心，得重懸菌體；

（6）、用T4 DNA連接酶將Rluc表達單元與pGEM-T載體連接，獲得重組載體pGEM-T-Rluc，pGEM-T Rluc重組體轉化入大腸桿菌DH5α；

（7）、以T7和SP6為引物，PCR鑒定重組體pGEM-T Rluc，陽性重組載體位于2526bp處。

2.根據權利要求1所述的一種雙熒光素酶報告基因表達載體pFireRluc的制備方法，其特征在于，以pmirGLO載體為模板，以R1/R2為引物進行擴增獲得Rluc序列片段，該序列兩端加上SalI酶切位點，以Sal I單酶切pGL4.10載體，將Rluc序列片段插入pGL4.10載體中，構建重組的pFireRluc雙熒光素酶報告基因載體；具體方法包括以下步驟：

（1）、設計Rluc引物：

根據pmirGLO質粒中的Rluc表達單元DNA序列設計引物R1、R2：

R1為5'-AAAGTCGACCGCGGATCTGCGCAGCACCATGGC-3'；

R2為5'-CCCGTCGACATCGATTCACACAAAAAACCAACACA-3'；

GTCGAC為Sal Ⅰ酶切位點；

（2）、PCR擴增：

以pmirGLO載體為模板，以R1、R2為引物進行PCR擴增，獲得Rluc表達單元；PCR擴增反應體系為：10×buffer 3μL，4×dNTPs 2μL，R1、R2各0.5μL，Pfu高保真酶0.5μL，ddH₂O18.5μL，模板DNA 5μL；反應條件：95℃預變性3min；95℃變性45s，55℃退火55s，72℃延伸90min，30個循環；72℃末延伸10min，得PCR擴增產物；

（3）、產物電泳：

取PCR擴增產物6μl與10×溴酚藍加樣緩沖液1μl混合，用含有溴化乙錠5μg/μl、1×TAE電泳緩沖液的質量濃度1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電壓5V/cm，用DNA Makrer2000判斷擴增片段大小，用凝膠分析系統照相，Rluc表達單元的擴增長度為2350bp；

（4）、對電泳質粒提取、純化，方法是：

A、在紫外光照射下，將含有目的基因片段的瓊脂糖凝膠快速切下，放在已稱重的1.5ml的Eppendorf管里，稱重；計算出凝膠塊的重量；

B、以凝膠塊的重量換算加入緩沖液Buffer DE-A的體積，加入3個凝膠體積的BufferDE-A，將盛有凝膠塊的離心管置于75℃水浴箱中加熱直到凝膠完全融化，溶膠時間不能超過10min，每2-3min搖動離心管加速凝膠溶解；

C、加入一半體積的緩沖液Buffer DE-B，混勻，終止溶膠；

D、將DNA制備柱置于2ml的離心管上，把上步驟中的混合液移入柱子，12000×g，離心1min；

E、棄濾液，把DNA制備柱放回原離心管中，加入500μl緩沖液Buffer W1，12000×g，離心30s；

F、棄濾液，把DNA制備柱放回離心管中，加入700μl緩沖液Buffer W2，再以12000×g，離心30s；

G、棄濾液，再次將DNA制備柱放回離心管中，加700μl緩沖液Buffer W2，以12000×g，離心1min；

H、棄濾液，將DNA制備柱放回離心管中，以12000×g，離心1min；

I、將制備柱放進一個干凈的1.5ml的Eppendorf管里，在纖維膜中心加30μl的洗脫液以洗脫DNA，讓其在室溫下靜置5min，然后以12000×g，離心1min，Eluent使用前用65℃水浴溫浴，提高洗脫效率，電泳驗證回收的目的片段長度在2350bp處，得Rluc PCR擴增產物；

（5）、制備DH5α感受態細菌：用接種環挑取LB固體培養基上的單個DH5α菌落，將其接種于5ml LB液體培養基中，37℃，2000×g，振蕩過夜，取5ml含DH5α菌液的LB液體加入30ml LB液體培養基中，2000×g，37℃振蕩培養4-6小時至對數生長期OD600≈0.3-0.4；無菌條件下，將菌液移至一個經過高壓滅菌處理的冰預冷的50ml聚丙烯管中，放置冰水混合物中10min，使培養物冷卻至0℃后，4℃，2700×g，離心10min，回收細菌；棄上清液；用冰預冷的0.1mmol/L CaCl2溶液10ml重懸菌體，置于冰水混合物中30min后，4℃，2700×g，離心10min，棄上清，加2ml冰預冷的0.1mmol/L CaCl₂重懸菌體；置4℃冰箱12-24h備用；

（6）、用T4 DNA連接酶將Rluc表達單元與pGEM-T載體連接，獲得重組載體pGEM-T-Rluc；連接反應體系為：2×Buffer 5μl，膠回收Rluc PCR擴增產物3μl，pGEM-T Easy載體1μl，T4DNA連接酶1μl，反應條件：將反應體系置于1.5ml Eppendorf管中，16℃過夜，pGEM-T Rluc重組體轉化入大腸桿菌DH5α；

（7）、以T7/SP6為引物，PCR鑒定重組體pGEM-T Rluc，陽性重組載體位于2526bp處。