[發(fā)明專利]雙熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體pFireRluc的制備方法及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810695795.0
• 申請(qǐng)日: 2018-06-29
• 公開（公告）號(hào): CN108728467A
• 公開（公告）日: 2018-11-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馮龍;趙國(guó)強(qiáng);路武豪;王黎;王媛媛;孫倩倩;吳建博;李志慧;史占江
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 河南中醫(yī)藥大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/65
• 分類號(hào): C12N15/65;C12N15/66;C12N15/70;C12Q1/02
• 代理公司: 鄭州天陽(yáng)專利事務(wù)所(普通合伙) 41113
• 代理人: 聶孟民

本發(fā)明涉及雙熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體pFireRluc的制備方法及其應(yīng)用，可有效解決測(cè)試系統(tǒng)受到細(xì)胞活性以及兩種不同的載體在轉(zhuǎn)染過(guò)程中轉(zhuǎn)染效率的影響問(wèn)題，以pmirGLO載體為模板，以R1/R2為引物進(jìn)行擴(kuò)增獲得Rluc序列片段，該序列兩端加上SalI酶切位點(diǎn)，以Sal I單酶切pGL4.10載體，將Rluc序列片段插入pGL4.10載體中，構(gòu)建重組的pFireRluc雙熒光素酶報(bào)告基因載體，有效用于真核細(xì)胞表達(dá)鑒定和對(duì)雙熒光素報(bào)告基因表達(dá)載體pFireRluc的活性檢驗(yàn)中，實(shí)現(xiàn)雙熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體pFireRluc在真核細(xì)胞表達(dá)鑒定中和活性試驗(yàn)中的應(yīng)用。本發(fā)明方法新穎獨(dú)特，提高實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可信度，減小細(xì)胞活性和轉(zhuǎn)染效率對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，能夠排除細(xì)胞活性和轉(zhuǎn)染效率對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性和可靠性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物，特別是一種雙熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體pFireRluc的制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

Luciferase報(bào)告基因系統(tǒng)是以熒光素(luciferin)為底物來(lái)檢測(cè)螢火蟲熒光素酶(fireflyluciferase)活性的一種報(bào)告系統(tǒng)。通過(guò)熒光素酶測(cè)定儀(luminometer)luciferin氧化過(guò)程中釋放的生物熒光，可以靈敏、高效地檢測(cè)基因的表達(dá)。該檢測(cè)系統(tǒng)是檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子與目的基因啟動(dòng)子區(qū)DNA相互作用的一種檢測(cè)方法。雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)試系統(tǒng)將螢火蟲和海腎熒光素酶共表達(dá)，用螢火蟲熒光素酶定量目的基因的表達(dá)，采用第二個(gè)報(bào)告基因（海腎熒光素酶）來(lái)減少實(shí)驗(yàn)的變化因素。傳統(tǒng)的共報(bào)告基因包括CAT，β-Gal，GUS不夠便利，因?yàn)楦髯缘臏y(cè)試化學(xué)，處理要求檢測(cè)特點(diǎn)存在差異。pGL4.10為Promega公司構(gòu)建的熒光素酶報(bào)告基因載體，含有螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因（Firefly），可用作定量分析哺乳動(dòng)物基因表達(dá)的工具。但由于pGL系列載體中只含有螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因，使用中無(wú)法排除本底因素的干擾，容易產(chǎn)生檢測(cè)誤差。此外，Promega公司也在此基礎(chǔ)上發(fā)展了雙報(bào)告基因技術(shù)，將螢火蟲熒光素酶測(cè)試和海腎熒光素酶測(cè)試相結(jié)合，引入pRL載體系統(tǒng)來(lái)表達(dá)第二個(gè)報(bào)告基因海腎熒光素酶，共轉(zhuǎn)染分別含有螢火蟲和海腎熒光素酶報(bào)告基因的載體質(zhì)粒于真核細(xì)胞中，可以在單管中進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)試。但該測(cè)試系統(tǒng)會(huì)受到細(xì)胞活性以及兩種不同的載體在轉(zhuǎn)染過(guò)程中轉(zhuǎn)染效率的影響。因此，研制新的雙熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體勢(shì)在必行。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)上述情況，為克服現(xiàn)有技術(shù)之缺陷，本發(fā)明之目的就是提供一種雙熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體pFireRluc的制備方法及其應(yīng)用，可有效解決測(cè)試系統(tǒng)受到細(xì)胞活性以及兩種不同的載體在轉(zhuǎn)染過(guò)程中轉(zhuǎn)染效率的影響問(wèn)題。

本發(fā)明解決的技術(shù)方案是，一種雙熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體pFireRluc的制備方法及其應(yīng)用，其制備方法是，以pmirGLO載體為模板，以R1/R2為引物進(jìn)行擴(kuò)增獲得Rluc序列片段，該序列兩端加上SalI酶切位點(diǎn)，以Sal I單酶切pGL4.10載體，將Rluc序列片段插入pGL4.10載體中，構(gòu)建重組的pFireRluc雙熒光素酶報(bào)告基因載體；具體方法包括以下步驟：

（1）、設(shè)計(jì)Rluc引物：

根據(jù)pmirGLO質(zhì)粒中的Rluc表達(dá)單元DNA序列設(shè)計(jì)引物R1、R2：

（2）、PCR擴(kuò)增：

以pmirGLO載體為模板，以R1、R2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得Rluc表達(dá)單元；

（3）、產(chǎn)物電泳：

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與10×溴酚藍(lán)加樣緩沖液混合，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，用DNAMakrer2000判斷擴(kuò)增片段大小，用凝膠分析系統(tǒng)照相；