[發(fā)明專利]一種四環(huán)素誘導(dǎo)啟動子及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810695136.7
• 申請日: 2018-06-29
• 公開（公告）號: CN108823208B
• 公開（公告）日: 2021-11-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 邢建民;郝學(xué)密;楊茂華;穆廷楨;江啟沛
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院過程工程研究所
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/74;C12N1/21;C12P21/00;C12R1/63
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟

本發(fā)明提供了一種四環(huán)素誘導(dǎo)啟動子及其制備方法和應(yīng)用，所述啟動子為將組成型啟動子的間隔序列突變?yōu)樗沫h(huán)素操縱基因；其中，所述間隔序列包括?35區(qū)至?10區(qū)之間的核酸序列、?10區(qū)至轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)之間的核酸序列或?(55±3)bp至?35區(qū)之間的核酸序列中的任意一種或至少兩種的組合。本發(fā)明將組成型啟動子的間隔序列突變?yōu)樗沫h(huán)素操縱基因，并利用四環(huán)素操縱基因與四環(huán)素阻遏蛋白的特異性結(jié)合作用，使得組成型啟動子受四環(huán)素誘導(dǎo)調(diào)控，實(shí)現(xiàn)了四環(huán)素對目的基因的表達(dá)調(diào)控；將包括四環(huán)素誘導(dǎo)啟動子和目的基因的表達(dá)載體導(dǎo)入嗜鹽嗜堿多能硫堿弧菌，高效啟動了目的基因的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了對嗜鹽嗜堿多能硫堿弧菌的改造。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種四環(huán)素誘導(dǎo)啟動子及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

嗜鹽嗜堿多能硫堿弧菌是一種高GC含量的革蘭氏陰性菌和好氧性光合硫細(xì)菌，可以在pH為7-11、Na⁺為0-4M的環(huán)境中生長。它是一種化能自養(yǎng)型微生物，以二氧化碳為碳源，硫化鈉或硫代硫酸鈉等硫物質(zhì)為電子供體，在氧化硫物質(zhì)的過程中產(chǎn)生單質(zhì)硫或硫酸鹽。相比于其他生物脫硫微生物，嗜鹽嗜堿多能硫堿弧菌對高鹽高堿環(huán)境具有耐受性，克服了傳統(tǒng)脫硫微生物脫硫率低的缺陷，但是存在生長速度慢的缺點(diǎn)，增加氧氣量可以加快嗜鹽嗜堿多能硫堿弧菌的生長速率，但會降低單質(zhì)硫的回收率，造成硫酸鹽大量積累，形成二次污染。對硫氧化菌進(jìn)行基因工程改造可以提高固定二氧化碳的速率，增加單質(zhì)硫的回收量，增強(qiáng)硫化物的脫除效果。

目前，基因工程的改造方法主要包括誘變和篩選，然而這些方法工作量大，效率較低。CN 105087625A公開了一種嗜鹽嗜堿硫堿弧菌的遺傳轉(zhuǎn)化方法，包括如下步驟：1)將分離純化后的菌株接種在硫堿弧菌合成培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為12～18h，OD₆₀₀值在0.5～0.9之間時收集菌體；2)通過CaCl₂-NaCl溶液處理的方法，制備具有吸附外源DNA能力的感受態(tài)細(xì)胞；3)通過熱激反應(yīng)，將外源的帶有抗性的質(zhì)粒導(dǎo)入步驟2)的感受態(tài)細(xì)胞中；4)將導(dǎo)入質(zhì)粒的感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行孵育，涂布在抗性平板上，篩選具有抗性的轉(zhuǎn)化菌株。然而這種篩選的方法效率較低，得到的優(yōu)良菌株的比例較低。

隨著嗜鹽嗜堿硫氧化菌基因組測序工作的完成，硫氧化菌的代謝網(wǎng)絡(luò)圖譜不斷完善，對硫氧化菌進(jìn)行定向基因編輯改造成為可能。發(fā)明人在前期的實(shí)驗(yàn)研究中，利用接合轉(zhuǎn)移的方式，將攜帶有異源基因的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入菌體，增強(qiáng)了硫堿弧菌的生長速率和脫硫速率。然而，啟動異源基因表達(dá)的啟動子僅限于組成型啟動子(例如Pgpx)，尚未構(gòu)建得到誘導(dǎo)型啟動子調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。此外，嗜鹽嗜堿硫氧化菌細(xì)胞膜上缺乏糖類分子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，因此傳統(tǒng)的乳糖、半乳糖或木糖等誘導(dǎo)型啟動子不能應(yīng)用于菌株中。

因此，提供一種誘導(dǎo)劑毒性小、可自由擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞的實(shí)用的誘導(dǎo)型啟動子，在生物技術(shù)領(lǐng)域具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種四環(huán)素誘導(dǎo)啟動子及其制備方法和應(yīng)用，所述四環(huán)素誘導(dǎo)啟動子在嗜鹽嗜堿多能硫堿弧菌中作為嚴(yán)謹(jǐn)型誘導(dǎo)啟動子，在轉(zhuǎn)錄水平高效調(diào)控基因表達(dá)，是搭建遺傳改造平臺不可或缺的元件。

為達(dá)此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

第一方面，本發(fā)明提供了一種四環(huán)素誘導(dǎo)啟動子，所述啟動子為將組成型啟動子的間隔序列突變?yōu)樗沫h(huán)素操縱基因；

其中，所述間隔序列包括-35區(qū)至-10區(qū)之間的核酸序列、-10區(qū)至轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)之間的核酸序列或-(55±3)bp至-35區(qū)之間的核酸序列中的任意一種或至少兩種的組合。

本發(fā)明中，將組成型啟動子的間隔序列突變?yōu)樗沫h(huán)素操縱基因，使得組成型啟動子受四環(huán)素誘導(dǎo)調(diào)控，實(shí)現(xiàn)了四環(huán)素對目的基因的表達(dá)調(diào)控。

優(yōu)選地，所述組成型啟動子包括谷氨酸過氧化物酶啟動子。

本發(fā)明中，所述谷氨酸過氧化物酶啟動子是嗜鹽嗜堿多能硫堿弧菌D301基因組中第847671-847457位的自身組成型啟動子。