[發明專利]一種四環素誘導啟動子及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201810695136.7
• 申請日: 2018-06-29
• 公開（公告）號: CN108823208B
• 公開（公告）日: 2021-11-02
• 發明（設計）人: 邢建民;郝學密;楊茂華;穆廷楨;江啟沛
• 申請（專利權）人: 中國科學院過程工程研究所
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/74;C12N1/21;C12P21/00;C12R1/63
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟

1.一種四環素誘導啟動子，其特征在于，所述啟動子為將組成型啟動子的間隔序列突變為四環素操縱基因；

其中，所述間隔序列包括-35區至-10區之間的核酸序列、-10區至轉錄起始位點之間的核酸序列或-(55±3) bp至-35區之間的核酸序列中的任意一種或至少兩種的組合；

所述四環素操縱基因的核酸序列如SEQ ID NO.2-3所示；

所述啟動子還包括tac啟動子、四環素阻遏蛋白基因和rrnBT1終止子。

2.根據權利要求1所述的啟動子，其特征在于，所述組成型啟動子包括谷氨酸過氧化物酶啟動子；

所述谷氨酸過氧化物酶啟動子的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一種表達載體，其特征在于，所述表達載體包括如權利要求1或2所述的四環素誘導啟動子。

4.根據權利要求3所述的表達載體，其特征在于，所述表達載體還包括目的基因。

5.一種宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞包括如權利要求3或4所述的表達載體。

6.根據權利要求5所述的宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞包括硫氧化菌。

7.根據權利要求6所述的宿主細胞，其特征在于，所述硫氧化菌包括嗜鹽嗜堿硫堿弧菌。

8.一種目的蛋白的表達方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

（1）構建如權利要求3或4所述的表達載體；

（2）將步驟（1）所述表達載體轉入感受態細胞，培養后挑取單克隆細胞進行篩選；

（3）采用接合轉移的方式，將篩選的表達載體轉入宿主細胞，進行目的蛋白的表達。

9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，步驟（1）所述構建的方法包括以下步驟：

（1’）構建包括組成型啟動子的克隆載體；

（2’）利用四環素操縱基因突變步驟（1’）所述組成型啟動子的間隔序列；

（3’）將tac啟動子、四環素阻遏蛋白和rrnBT1終止子連接入克隆載體，得到包括四環素誘導啟動子的克隆載體；

（4’）PCR擴增步驟（3’）所述克隆載體的四環素誘導啟動子片段，連接入帶有目的基因的表達載體，得到所述包括四環素誘導啟動子的表達載體。

10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于，步驟（1’）所述組成型啟動子包括谷氨酸過氧化物酶啟動子。

11.根據權利要求9所述的方法，其特征在于，步驟（2’）所述間隔序列包括-35區至-10區之間的核酸序列、-10區至轉錄起始位點之間的核酸序列或-(55±3) bp至-35區之前的核酸序列中的任意一種或至少兩種的組合。

12.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，步驟（1）所述構建的方法采用的引物如SEQ ID NO.4-16所示。

13.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，步驟（2）所述感受態細胞包括大腸桿菌。