[發明專利]一種RXRα蛋白穩定低表達的RXRα基因敲除細胞系及其制備方法

有效

• 申請號: 201810692094.1
• 申請日: 2018-06-28
• 公開（公告）號: CN108753732B
• 公開（公告）日: 2021-01-26
• 發明（設計）人: 張建清;李云秀;蔣友勝;吳東亭;彭金鈴
• 申請（專利權）人: 深圳市疾病預防控制中心（深圳市衛生檢驗中心;深圳市預防醫學研究所）
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/90
• 代理公司: 深圳市蘭鋒盛世知識產權代理有限公司 44504
• 代理人: 羅炳鋒

本發明屬于生物制備技術領域，特別涉及一種RXRα蛋白穩定低表達的RXRα基因敲除細胞系及其制備方法。所述細胞系為RXRα基因敲除細胞系，敲除的堿基數為非3的整數倍，細胞內RXRα蛋白表達明顯下降且基因型穩定可傳代，從而大大提升了RXRα蛋白低表達細胞系的穩定性，利于細胞系的穩定傳代與持續培養。本發明提供了一種所述細胞系的制備方法，根據RXRα基因序列信息，設計CRISPR敲除gRNA序列，構建gRNA表達載體，體外細胞水平檢測gRNA剪切活性。隨后采用核轉的方法，利用cas9及gRNA表達載體共轉染人神經母細胞瘤的永生化細胞即SK?N?SH細胞，經G418藥物篩選得到穩定細胞克隆，PCR及基因測序鑒定其為RXRα基因非3整數倍基因敲除的細胞克隆，得到RXRα蛋白穩定低表達的RXRα基因敲除細胞系。

技術領域

本發明屬于生物制備技術領域，特別涉及一種RXRα蛋白穩定低表達的RXRα基因敲除細胞系。

背景技術

RXR(Homo sapiens retinoid X receptor，人類視黃醇X受體)基因的mRNA主要有三種剪接體，分別為RXRα(NM_002957.5)，RXRβ(NM_001291920.1)，RXRγ(NM_001291921.1)。

細胞內RXRα受體可與多種藥物相結合，與人類很多種疾病包括但不限于腫瘤、糖尿病、神經退行性疾病、脂肪性肝炎密切相關。構建RXRα蛋白高表達與低表達細胞系，將有助于探討與RXRα受體相關疾病發病機理以及開發針對疾病靶點的有效藥物。CRISPR/Cas技術是使用一段特異性向導RNA分子(sequence-specific guide RNA)引導核酸內切酶cas9蛋白到靶點處進行切割，形成DNA雙鏈斷裂(Double-Stranded Break,DSB)，這種DNA的損傷可以啟動細胞內的修復機制，主要包括兩種途徑：第一種是低保真性的非同源末端連接途徑(NHEJ,Non-homologous endjoining)，NHEJ是細胞內主要的DNA斷裂損傷修復機制，此修復機制非常容易發生錯誤，導致修復后發生堿基的缺失或插入，從而造成移碼突變，最終達到基因敲除的目的。第二種DNA斷裂修復途徑為同源介導的修復(HR,homology-directedrepair)，這種基于同源重組的修復機制保真性高，但是發生概率低。

諸如前述，有效的構建一種RXRα蛋白穩定低表達細胞系對于RXRα蛋白在生物體內的生物學效應的研究及其相關疾病的藥物的開發至關重要，本發明擬解決這一問題。

發明內容

鑒于現有技術存在的問題，本發明的首要目的在于提供一種RXRα蛋白穩定低表達的RXRα基因敲除細胞系，該細胞系為由取自人神經母細胞瘤的永生化細胞(SK-N-SH細胞)敲除經設計的基因序列后得到的細胞系(RXR/KO-SK-N-SH細胞)，敲除的位點為RXRα基因第4外顯子第1-180堿基。

具體地，該細胞系分別為RXR/KO-SK-N-SH-7#(或RXR/KO-SK-N-SH-35#)和RXR/KO-SK-N-SH-15#，RXR/KO-SK-N-SH-7#(或RXR/KO-SK-N-SH-35#)為RXRα等位基因敲除純合子細胞系；RXR/KO-SK-N-SH-15#為RXRα基因雙基因型敲除細胞系；敲除的序列分別為RXRα第4外顯子第61-122(62bp)和61-122(62bp)、61-70(10bp)、114-141(28bp)堿基，序列分別為SeqNo.1、Seq No.2和Seq No.3。