[發(fā)明專利]一種RXRα蛋白穩(wěn)定低表達(dá)的RXRα基因敲除細(xì)胞系及其制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810692094.1
• 申請日: 2018-06-28
• 公開（公告）號: CN108753732B
• 公開（公告）日: 2021-01-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張建清;李云秀;蔣友勝;吳東亭;彭金鈴
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳市疾病預(yù)防控制中心（深圳市衛(wèi)生檢驗中心;深圳市預(yù)防醫(yī)學(xué)研究所）
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/90
• 代理公司: 深圳市蘭鋒盛世知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44504
• 代理人: 羅炳鋒

1.一種RXRα蛋白穩(wěn)定低表達(dá)的RXRα基因敲除細(xì)胞系，其特征在于，該細(xì)胞系為由取自人神經(jīng)母細(xì)胞瘤的永生化細(xì)胞即SK-N-SH細(xì)胞，經(jīng)CRISPR DESIGN軟件設(shè)計敲除靶位點(diǎn)，經(jīng)基因敲除后得到的細(xì)胞克隆，基因敲除靶位點(diǎn)為RXRα基因第4外顯子第1-180堿基；

該細(xì)胞系分別為RXR/KO-SK-N-SH-7#和RXR/KO-SK-N-SH-15#；

RXR/KO-SK-N-SH-7#為RXRα等位基因敲除純合子，RXR/KO-SK-N-SH-15#為RXRα基因雙基因型敲除細(xì)胞系，分別為第61-122(62bp)和第61-122(62bp)、61-70(10bp)、114-141(28bp)堿基缺失，敲除的序列分別為Seq No.1和Seq No.2、Seq No.3。

2.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的RXRα蛋白穩(wěn)定低表達(dá)的RXRα基因敲除細(xì)胞系的制備方法，其特征在于，

(1)根據(jù)RXRα基因序列信息，設(shè)計CRISPR敲除gRNA，構(gòu)建gRNA表達(dá)載體，將gRNA表達(dá)載體、cas9表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染PK15豬腎細(xì)胞體外細(xì)胞水平檢測gRNA剪切活性；

(2)采用核轉(zhuǎn)的方法，gRNA表達(dá)載體與cas9表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SK-N-SH，采用G418藥物篩選得到穩(wěn)定細(xì)胞克隆，PCR及基因測序鑒定其是否為RXRα基因非3整數(shù)倍堿基缺失的基因敲除細(xì)胞克隆，最終通過Western blot鑒定其RXRα蛋白表達(dá)水平，得到基因型可穩(wěn)定遺傳的RXRα基因敲除細(xì)胞系。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，包括以下制備步驟：

(1)RXRα基因敲除靶位點(diǎn)的設(shè)定、gRNA的設(shè)計；

(2)構(gòu)建gRNA表達(dá)載體；

(3)gRNA剪切活性的鑒定：脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，通過T7E1酶切鑒定gRNA剪切活性；

(4)RXRα基因敲除細(xì)胞系的篩選：將gRNA表達(dá)載體、cas9表達(dá)載體通過核轉(zhuǎn)的方式共轉(zhuǎn)染SK-N-SH神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，加G418進(jìn)行篩選、克隆、培養(yǎng)；

(5)RXRα基因敲除細(xì)胞系的鑒定。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)為根據(jù)RXRα基因序列，選擇RXRα-a/b/c共有的exon4作為敲除位點(diǎn)，設(shè)計CRISPR敲除靶位點(diǎn)，選定的敲除靶位點(diǎn)為RXRα基因第4外顯子第1-180的堿基，分別以RXRα基因第4外顯子的第44-66(CTTCAAGCGGACGGTGCGCAAGG)、79-101(CCTGCCGCGACAACAAGGACTGC)、106-128(TTGACAAGCGGCAGCGGAACCGG)堿基設(shè)計DNA Oligos引物以合成雙鏈gRNA；

應(yīng)用在線軟件CRISPRDESIGN設(shè)計CRISPR敲除gRNA，合成互補(bǔ)的DNA Oligos引物。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)為gRNA載體的構(gòu)建，具體方法包括：gRNA合成后，用水溶解引物成10μM，上下游各加10μL，95℃，10min，室溫30min，然后連接骨架，骨架為連了U6啟動子和gRNAtail的T載體，酶切位點(diǎn)為BsaI，骨架做好后，用T4連接酶在16℃連接4h。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)為運(yùn)用CRISPR-Cas9的方法通過瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并檢測目的基因的完整性來驗證質(zhì)粒的剪切活性；:

(3.1)復(fù)蘇PK15豬腎細(xì)胞于24孔板，共4孔，按invitrogen lipofectamin2000說明書瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞；一孔轉(zhuǎn)染EGFP質(zhì)粒，以觀察轉(zhuǎn)染效率，另三孔分別共轉(zhuǎn)染gRNA載體質(zhì)粒；

(3.2)參照PK15豬腎細(xì)胞轉(zhuǎn)染EGFP質(zhì)粒17h后熒光表達(dá)強(qiáng)度，確定目的轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染情況；

(3.3)細(xì)胞轉(zhuǎn)染完成48h后收集細(xì)胞提取DNA，用T7內(nèi)切酶法進(jìn)行活性鑒定；

反應(yīng)程序：37℃酶切60min。