[發(fā)明專利]一種單細(xì)胞測序篩選淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記分子的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810691765.2
• 申請日: 2018-06-28
• 公開（公告）號: CN109576356A
• 公開（公告）日: 2019-04-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 趙永祥;薛志剛;陽諾;鐘莉娉
• 申請（專利權(quán)）人: 廣西醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869
• 代理公司: 北京科億知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11350
• 代理人: 韋肖燕

本發(fā)明公開了一種利用單細(xì)胞測序篩選淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記分子的方法，包括以下步驟：（1）提取腫瘤淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞；（2）分離單細(xì)胞并進行裂解；（3）對樣品的mRNA進行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA；（4）以cDNA為模板進行PCR擴增，產(chǎn)物純化，進行Tagmentation反應(yīng)，完成cDNA測序文庫構(gòu)建；（5）對構(gòu)建的cDNA文庫進行高通量測序；（6）測序結(jié)果進行生物信息學(xué)分析，尋找腫瘤淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞特異性的標(biāo)記分子。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其是涉及一種利用單細(xì)胞測序篩選淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記分子的方法。

背景技術(shù)

淋巴道轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的重要途徑之一，而腫瘤相關(guān)微淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞是腫瘤發(fā)生 淋巴道轉(zhuǎn)移的重要界面。

腫瘤相關(guān)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞是位于腫瘤組織及周邊組織淋巴管腔面的一層單層扁平內(nèi)皮 細(xì)胞，是腫瘤淋巴管的主要構(gòu)成單元。淋巴管轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤難以根治和高病死率的重要原因。淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移以及耐藥方面起重要作用，是腫瘤治療的良好靶點，是提高腫瘤治療效果的一種有效方法。

因此，若能不斷發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性標(biāo)記分子及調(diào)控因子，從分子水平探討腫瘤細(xì)胞與其相關(guān)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互作用，可為深刻揭示腫瘤轉(zhuǎn)移的機制提供更有效的科學(xué)依據(jù)，同時也能為臨床早期阻斷淋巴道轉(zhuǎn)移提供新思路和新方法 。

我們利用單細(xì)胞測序技術(shù)在腫瘤相關(guān)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的單細(xì)胞水平上對全轉(zhuǎn)錄組進行擴增與測序，在整體水平上研究細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄的情況及轉(zhuǎn)錄調(diào)控的規(guī)律，最后利用生物信息學(xué)分析技術(shù)，從mRNA水平上分析尋找腫瘤相關(guān)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性標(biāo)記分子，為腫瘤的靶向治療提供新靶點。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于針對上述存在的科學(xué)問題，提供一種單細(xì)胞測序篩選淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記分子的方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：

本發(fā)明的單細(xì)胞測序篩選淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記分子的方法，包括以下步驟：

1）提取腫瘤淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞；

2）分離單細(xì)胞并進行裂解：分離單細(xì)胞，加入裂解緩沖液中進行裂解，得到細(xì)胞裂解液；

3）對樣品的mRNA進行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA：使用美國ThermoFisher公司的SuperScript試劑盒構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄體系，對上述步驟2）獲得的細(xì)胞裂解液進行逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA；

4）以cDNA為模板進行PCR擴增，構(gòu)建測序文庫，進行測序：使用美國Illumina公司的NexteraXT試劑盒，按照說明書對上述步驟3）得到的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行擴增和純化，構(gòu)建高通量測序文庫；完成后將文庫送交測序；

5）對測序結(jié)果進行生物信息學(xué)分析，從mRNA水平上分析尋找腫瘤淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性標(biāo)記分子。

以上所述步驟1）中，將從腫瘤組織中提取的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞進行單細(xì)胞測序，利用生物信息學(xué)分析從mRNA水平上尋找其特異的標(biāo)記分子。

本發(fā)明突出的實質(zhì)性特點和顯著的進步是：

通過利用單細(xì)胞測序技術(shù)，將從腫瘤組織中提取的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞進行單細(xì)胞測序，利用生物信息學(xué)分析從mRNA水平上尋找其特異的標(biāo)記分子，為腫瘤靶向治療尋找新的靶點提供更為全面、客觀、準(zhǔn)確的方法。

附圖說明

圖1為純化后的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞。

圖2為淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定。

圖3為淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的成管實驗鑒定。

具體實施方式