[發明專利]一種利用無血清培養基生產PEDV弱毒疫苗的方法

有效

• 申請號: 201810690966.0
• 申請日: 2018-06-29
• 公開（公告）號: CN108853489B
• 公開（公告）日: 2019-07-02
• 發明（設計）人: 杜恩岐;陳瑞
• 申請（專利權）人: 陜西諾威利華生物科技有限公司
• 主分類號: A61K39/215
• 分類號: A61K39/215;A61P31/14;C12N7/00
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• 代理人: 暫無信息

本發明涉及一種利用無血清培養基生產PEDV弱毒疫苗的方法，其特征在于，所述無血清培養基由基礎培養基，牛血清白蛋白，皮質醇，胰島素，轉鐵蛋白，谷胱甘肽，胰蛋白酶，?；撬岷蛠單徕c組成，其中牛磺酸和亞硒酸鈉的重量份配比比例為2?3:1。該培養基不添加動物血清，極大地降低了生產成本，提高了生產的經濟效益，并且還避免了血清使用所帶來的諸多問題。

技術領域：

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種利用無血清培養基生產PEDV弱毒疫苗的方法。

背景技術：

豬流行性腹瀉（PED）是由豬流行性腹瀉病毒（PEDV）引起的急性和高度傳染性的腸道病毒性疾病,其癥狀包括腹瀉，嘔吐，厭食，脫水和仔豬體重減輕。雖然不同年齡段的豬都可能受到不同程度的感染并出現癥狀，但仔豬的病情特別嚴重，其中死亡率高達100％，PEDV主要通過小豬的腸粘膜表面進入宿主，主要導致腸上皮細胞損傷。雖然不同年齡段的豬都可能受到不同程度的感染并出現癥狀，但仔豬的病情特別嚴重，其中死亡率高達100％，PEDV主要通過小豬的腸粘膜表面進入宿主，主要導致腸上皮細胞損傷。針對PEDV的大爆發，我們通?？梢圆捎靡呙绮呗詠砜刂芇EDV，并且在中國已經廣泛開展了用殺死或減毒的PEDV疫苗進行疫苗接種，在一定程度上控制了PEDV的大規模爆發。但隨著中國PEDV滅活或減毒二聯疫苗的廣泛使用，PED在全國范圍內持續蔓延至2010年10月，當時出現變異株，PEDV感染急劇增加，嚴重危害養豬業。雖然國內用于流行性腹瀉的疫苗（包括二聯滅活苗及二聯活疫苗）得到了廣泛的推廣和應用，并且在一定范圍和程度上減少了豬流行性腹瀉的發病率，但是該病仍然未能得到完全控制，尤其在2010年10月至今，該病呈持續性，爆發性增長趨勢。

通常，PEDV采用vero細胞進行培養和增殖，進而滅活制備得到PEDV滅活疫苗。目前，基于vero細胞培養PEDV疫苗的生產過程多采用兩階段操作工藝， 即：前期在有血清的培養基中使細胞增殖至所需密度；后期通過洗滌去除血清成分及代謝廢物，更換為低血清或無血清培養基以支持病毒在細胞中感染和復制。然而，現有疫苗生產中，前期vero細胞的培養液以商業化的培養基配合小?；蛘唏R血清進行培養和生產。血清組分的復雜性和不確定性及批次間的差異增加了疫苗等細胞產品生產及質量控制的難度，同時血清易引起細菌、真菌、病毒及支原體的污染，增加了疫苗生產的安全性隱患。并且血清本身價格也比較昂貴，這些均使得血清在PEDV疫苗的生產和研究中的應用存在諸多不利。實踐已證明無血清培養基不僅能在很大程度上避免或改善含血清培養基所帶來的上述缺陷 , 也能取得較好的培養效果。并且由于其明確的成分組成, 可避免血清的不同批次或不明組分對細胞培養及試驗研究的影響 , 從而提高結果的可重復性。因此, 基于PEDV疫苗生產中血清使用所存在的諸多問題以及生產成本高昂，因此，盡量減少血清的用量一直是疫苗生產中研究的課題，低血清以及無血清培養基的開發和應用勢在必行。

發明內容：

為解決以上技術問題，及現有技術中血清使用所存在的諸多問題以及生產成本高昂，本發明旨在提供一種利用無血清培養基生產PEDV弱毒疫苗的方法，該培養基不添加動物血清，極大地降低了生產成本，提高了生產的經濟效益，并且還避免了血清使用所帶來的諸多問題。

為解決以上技術問題，本發明采用如下技術手段：

一種利用無血清培養基生產PEDV弱毒疫苗的方法，所述方法包括如下步驟：

步驟（1），Vero細胞的復蘇；

步驟（2），Vero細胞的傳代擴增；

步驟（3），在Vero細胞上接種PEDV病毒毒株；

步驟（4），收獲感染細胞培養上清液，病毒液進行澄清過濾；

步驟（5），加入凍干保護劑，分裝凍干；