[發(fā)明專(zhuān)利]一種生產(chǎn)黃嘌呤的重組菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810687083.4
• 申請(qǐng)日: 2018-06-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110656073B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-06-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙廣;劉敏;咸漠;高文杰
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C12N1/21
• 分類(lèi)號(hào): C12N1/21;C12P17/18;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽(yáng)光惠遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 鄧宇

本發(fā)明公開(kāi)了一種生產(chǎn)黃嘌呤的重組菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。該重組菌是以大腸桿菌為出發(fā)菌株，分別敲除大腸桿菌基因組上的轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白基因purR、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶基因pgi、磷酸葡萄糖酸脫水酶基因edd、腺苷酸琥珀酸合成酶基因purA和GMP合成酶基因guaA，過(guò)表達(dá)D128A突變的PRPP合成酶基因prs和K326Q、P410W雙突變的PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶purF。同時(shí)，本發(fā)明還提供了該重組菌的制備方法及利用該重組菌的生產(chǎn)黃嘌呤的方法。本發(fā)明首次實(shí)現(xiàn)了重組菌中黃嘌呤的高效生物合成。該重組菌適用于發(fā)酵生產(chǎn)黃嘌呤。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)黃嘌呤的重組菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

嘌呤堿基及其核苷類(lèi)產(chǎn)品在醫(yī)藥和食品領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。這類(lèi)產(chǎn)品能影響神經(jīng)系統(tǒng)活動(dòng)，產(chǎn)生心血管效應(yīng)，可起到鎮(zhèn)靜、擴(kuò)張血管、降血壓等作用。開(kāi)發(fā)研制具有抗腫瘤、抗病毒活性的核苷及其衍生物等新藥已成為當(dāng)今研究熱點(diǎn)方向之一。此外，其還可用于生產(chǎn)各種功能性食品，包括抗寒食品、減肥食品等。黃嘌呤(xanthine)是一種廣泛分布于人體及其他生物體的器官及體液內(nèi)的一種嘌呤堿，常用作溫和的興奮劑和支氣管擴(kuò)張劑，特別用于治療哮喘癥狀。咖啡因、茶堿及可可堿等常見(jiàn)的溫和興奮劑均由黃嘌呤衍生出來(lái)。黃嘌呤是嘌呤衍生物，很少在核酸的成分中發(fā)現(xiàn)。目前，黃嘌呤的合成方法主要為化學(xué)法合成，通過(guò)4-氨基-5-甲酰氨基脲嗪與甲酰胺在180-185℃反應(yīng)而得。黃嘌呤的化學(xué)合成法需要在高溫條件下進(jìn)行，對(duì)設(shè)備的要求較高，影響了黃嘌呤的生產(chǎn)成本。因此，利用生物法合成黃嘌呤的研究逐漸受到關(guān)注。目前嘌呤類(lèi)化合物的生產(chǎn)菌株主要利用誘變篩選技術(shù)獲得，但往往耗時(shí)長(zhǎng)、效率低、而且獲得的菌株存在不穩(wěn)定的缺陷。雖然細(xì)胞內(nèi)嘌呤的生物合成路線早已探明，然而其合成路線較長(zhǎng)、并受到細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄阻遏和轉(zhuǎn)錄衰減調(diào)控、酶的底物反饋抑制調(diào)控等，嘌呤主要用于合成細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)，難以在細(xì)胞內(nèi)積累。同時(shí)，現(xiàn)有的技術(shù)尚沒(méi)有重組菌制備黃嘌呤的報(bào)道。大腸桿菌因其培養(yǎng)成本低、生長(zhǎng)速度快、基因操作簡(jiǎn)便，是微生物合成領(lǐng)域的首選宿主之一。因此，通過(guò)對(duì)嘌呤合成途徑的調(diào)控，利用代謝工程的方法建立高效的黃嘌呤生物合成技術(shù)具有重要的意義，將開(kāi)拓生物法合成黃嘌呤的新領(lǐng)域。

發(fā)明內(nèi)容

為實(shí)現(xiàn)利用生物法大量合成黃嘌呤，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)黃嘌呤的重組菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，采用的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明的目的在于提供一種合成黃嘌呤的重組菌，該重組菌以大腸桿菌為出發(fā)菌株，敲除大腸桿菌基因組上的轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白基因purR、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶基因pgi、磷酸葡萄糖酸脫水酶基因edd、腺苷酸琥珀酸合成酶基因purA和GMP合成酶基因guaA，過(guò)表達(dá)D128A突變的PRPP合成酶基因prs和K326Q、P410W雙突變的PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶purF。

優(yōu)選地，所述D128A突變的PRPP合成酶基因prs的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述K326Q、P410W雙突變的PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶purF的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

優(yōu)選地，以大腸桿菌W3110為出發(fā)菌株。

優(yōu)選地，所述PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶基因purF和PRPP合成酶基因prs均來(lái)源于大腸桿菌(Escherichia coli)。

本發(fā)明提供了一種上述任一所述重組菌的構(gòu)建方法，該方法包括如下步驟：

1)利用片段搭橋法分別克隆獲得K326Q、P410W雙突變的PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶purF(K326Q、P410W)，D128A突變的PRPP合成酶基因prs(D128A)

2)將步驟1)所得的K326Q、P410W雙突變的PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶基因purF(K326Q、P410W)連接到質(zhì)粒載體pACYCDuet-1，獲得重組質(zhì)粒I；

3)將步驟1)所得的D128A突變的PRPP合成酶基因prs(D128A)連接到重組質(zhì)粒I上，獲得重組質(zhì)粒II；