[發明專利]一種生產黃嘌呤的重組菌及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 201810687083.4
• 申請日: 2018-06-28
• 公開（公告）號: CN110656073B
• 公開（公告）日: 2022-06-28
• 發明（設計）人: 趙廣;劉敏;咸漠;高文杰
• 申請（專利權）人: 中國科學院青島生物能源與過程研究所
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P17/18;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 鄧宇

1.一種合成黃嘌呤的重組菌，其特征在于，該重組菌以大腸桿菌為出發菌株，敲除大腸桿菌基因組上的轉錄阻遏蛋白基因purR、磷酸葡萄糖異構酶基因pgi、磷酸葡萄糖酸脫水酶基因edd、腺苷酸琥珀酸合成酶基因purA和GMP合成酶基因guaA，過表達D128A突變的PRPP合成酶基因prs和K326Q、P410W雙突變的PRPP轉酰胺酶purF。

2.根據權利要求1所述的重組菌，其特征在于，所述D128A突變的PRPP合成酶基因prs的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述K326Q、P410W雙突變的PRPP轉酰胺酶purF的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根據權利要求1所述的重組菌，其特征在于，以大腸桿菌W3110為出發菌株。

4.一種權利要求1-3任一所述重組菌的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)利用片段搭橋法分別克隆獲得K326Q、P410W雙突變的PRPP轉酰胺酶purF，D128A突變的PRPP合成酶基因prs；

2)將步驟1)所得的K326Q、P410W雙突變的PRPP轉酰胺酶基因purF連接到質粒載體pACYCDuet-1，獲得重組質粒I；

3)將步驟1)所得的D128A突變的PRPP合成酶基因prs連接到重組質粒I上，獲得重組質粒II；

4)以大腸桿菌W3110為出發菌株，敲除大腸桿菌W3110基因組的轉錄阻遏蛋白基因purR、磷酸葡萄糖異構酶基因pgi、磷酸葡萄糖酸脫水酶基因edd、腺苷酸琥珀酸合成酶基因purA和GMP合成酶基因guaA，獲得突變菌株W3110△purR△pgi△edd△purA△guaA；

5)將步驟3)所得的重組質粒II導入步驟4)所得突變菌株，獲得重組菌。

5.權利要求4所述的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)以大腸桿菌的基因組DNA為模板，以引物SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6克隆K326Q突變的PRPP轉酰胺酶基因purF的上游片段，以引物SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.7克隆K326Q突變的PRPP轉酰胺酶基因purF的下游片段，以引物SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5，利用片段搭橋法搭橋K326Q突變的PRPP轉酰胺酶基因purF的上游和下游片段，獲得如SEQ ID NO.3所示的K326Q突變的PRPP轉酰胺酶基因purF；以K326Q突變的PRPP轉酰胺酶基因purF為模板，以引物SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.8克隆P410W突變的PRPP轉酰胺酶基因purF的上游片段，以引物SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.9克隆P410W突變的PRPP轉酰胺酶基因purF的下游片段，以引物SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5，利用片段搭橋法搭橋P410W突變的PRPP轉酰胺酶基因purF的上游和下游片段，獲得如SEQ ID NO.2所示的K326Q、P410W雙突變的PRPP轉酰胺酶基因purF；

2)將步驟1)所得的K326Q、P410W雙突變的PRPP轉酰胺酶基因purF連接到質粒載體pACYCDuet-1，獲得重組質粒pACYCDuet1-purF；

3)以大腸桿菌的基因組DNA為模板，以引物SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11克隆D128A突變的PRPP合成酶基因prs的上游片段，以引物SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13克隆D128A突變的PRPP合成酶基因prs的下游片段，以引物SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.13，利用片段搭橋法搭橋D128A突變的PRPP合成酶基因prs的上游和下游片段，獲得如SEQ ID NO.1所示的D128A突變的PRPP合成酶基因prs；

4)將步驟3)所得的D128A突變PRPP合成酶基因prs連接到步驟2)所得的重組質粒，獲得新的重組質粒pACYCDuet1-prs(D128A)-purF(K326Q、P410W)；

5)利用P1噬菌體轉導法分別敲除大腸桿菌W3110基因組的轉錄阻遏蛋白基因purR、磷酸葡萄糖異構酶基因pgi、磷酸葡萄糖酸脫水酶基因edd、腺苷酸琥珀酸合成酶基因purA和GMP合成酶基因guaA，獲得突變菌株W3110△purR△pgi△edd△purA△guaA；

6)將步驟4)所得的重組質粒導入步驟5)所得的突變菌株，獲得重組菌W3110△purR△pgi△edd△purA△guaA/pACYCDuet1-prs(D128A)-purF(K326Q、P410W)。