[發明專利]一種海洋無脊椎動物細胞培養方法

在審

• 申請號: 201810681617.2
• 申請日: 2018-06-27
• 公開（公告）號: CN109022345A
• 公開（公告）日: 2018-12-18
• 發明（設計）人: 王天明;楊靜文;梁晶;陳旭;其他發明人請求不公開姓名
• 申請（專利權）人: 浙江海洋大學
• 主分類號: C12N5/07
• 分類號: C12N5/07
• 代理公司: 杭州千克知識產權代理有限公司 33246
• 代理人: 黃周榮

本發明公開了一種海洋無脊椎動物細胞培養方法，該方法包括：(1)解剖采集海洋無脊椎動物組織樣品，對組織樣品進行清洗消毒；(2)將清洗消毒后的組織樣品置于一級培養基中，進行酶解消化，獲原代細胞懸液；(3)將原代細胞懸液分散到二級培養基中，進行預培養；(4)更換三級培養基進行后培養；(5)待原代細胞密度達到60％時，收集后培養后的細胞，經稀釋后轉移至三級培養基中，進行傳代培養。本申請通過在海洋無脊椎動物細胞的不同培養階段采用不同的培養基，以適應海洋無脊椎動物細胞在不同培養階段對培養要求的差異；能夠長期培養具有較好活力的海洋無脊椎動物細胞，培養方法具有快速易操作、穩定易重復的特點。

技術領域

本發明屬于海洋生物細胞培養技術領域，具體涉及一種海洋無脊椎動物細胞培養方法。

背景技術

隨著生命科學的迅猛發展，在生物工程技術領域中，細胞工程已愈來愈受到重視。從某種意義上說，基因工程是現代生物技術的核心，而細胞工程是現代生物技術的基礎和公用平臺。細胞培養是開展細胞學基礎研究、細胞結構與功能驗證及細胞工程學研究必不可少的研究手段。

原代培養是指由體內取出細胞、組織和器官后進行的首次培養，也叫初代培養。由于培養的細胞剛剛從活體組織分離出來，故更接近于生物體內的生活狀態。細胞系作為一種體外表達系統，專一性好，可重復性高，是一種有用的實驗材料。

海洋生物細胞培養研究由于起步較晚，而且海洋生物的生活環境與陸地生物之間存在巨大差異，目前尚缺乏海洋無脊椎動物穩定可靠的細胞培養技術方案，這就使得運用細胞生物學研究方法探究海洋無脊椎動物生理調控機理、開發細胞工程應用技術遇到極大的挑戰。

發明內容

本申請的發明目的是提供一種快速易操作、穩定易重復的海洋無脊椎動物細胞培養方法。

為實現上述發明目的，本申請的技術方案如下：

一種海洋無脊椎動物細胞培養方法，該方法包括以下步驟：

(1)解剖采集海洋無脊椎動物組織樣品，對組織樣品進行清洗消毒；

(2)將清洗消毒后的組織樣品置于一級培養基中，進行酶解消化，獲原代細胞懸液；

(3)將原代細胞懸液分散到二級培養基中，進行預培養；

(4)更換三級培養基進行后培養；

(5)待原代細胞密度達到60％時，收集后培養后的細胞，經稀釋后轉移至三級培養基中，進行傳代培養。

本申請是在現有模式動物細胞培養技術的基礎上、針對海洋無脊椎動物高鹽度環境特征建立的細胞傳代培養技術，本申請通過在海洋無脊椎動物細胞的不同培養階段采用不同的培養基，以適應海洋無脊椎動物細胞在不同培養階段對培養要求的差異；這就使得本申請的細胞培養方法更契合海洋無脊椎動物細胞的生長增殖曲線，實現了對刺參、海膽、烏賊等海洋無脊椎動物的成體組織細胞進行貼壁培養，既提高海洋無脊椎動物細胞的存活率，有能夠長期培養具有較好活力的海洋無脊椎動物細胞，培養方法具有快速易操作、穩定易重復的特點，從而能夠為建立海洋無脊椎動物細胞研究平臺、開發相關細胞工程技術奠定良好基礎。

作為優選，步驟(1)中，所述的清洗消毒是將組織樣品置于體積分數為75％的乙醇水溶液中浸泡不超過5min，迅速取出后采用一級培養基清洗以去除乙醇。

作為優選，步驟(2)中，所述的一級培養基的配方為：

配制完成后，采用0.22μm濾膜對一級培養基進行過濾除菌后再使用。下述的二級培養基和三級培養基也采用采用0.22μm濾膜進行過濾除菌。

作為優選，步驟(2)中，在酶解消化前將組織樣品進行無菌剪碎，所述的酶解消化是在常溫下采用胰酶對剪碎后的組織樣品進行消化。