[發(fā)明專利]一種海洋無脊椎動物細(xì)胞培養(yǎng)方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810681617.2
• 申請日: 2018-06-27
• 公開（公告）號: CN109022345A
• 公開（公告）日: 2018-12-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王天明;楊靜文;梁晶;陳旭;其他發(fā)明人請求不公開姓名
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江海洋大學(xué)
• 主分類號: C12N5/07
• 分類號: C12N5/07
• 代理公司: 杭州千克知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 33246
• 代理人: 黃周榮

1.一種海洋無脊椎動物細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)解剖采集海洋無脊椎動物組織樣品，對組織樣品進(jìn)行清洗消毒；

(2)將清洗消毒后的組織樣品置于一級培養(yǎng)基中，進(jìn)行酶解消化，獲原代細(xì)胞懸液；

(3)將原代細(xì)胞懸液分散到二級培養(yǎng)基中，進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)；

(4)更換三級培養(yǎng)基進(jìn)行后培養(yǎng)；

(5)待原代細(xì)胞密度達(dá)到60％時，收集后培養(yǎng)后的細(xì)胞，經(jīng)稀釋后轉(zhuǎn)移至三級培養(yǎng)基中，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

2.如權(quán)利要求1所述的海洋無脊椎動物細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(1)中，所述的清洗消毒是將組織樣品置于體積分?jǐn)?shù)為75％的乙醇水溶液中浸泡不超過5min，迅速取出后采用一級培養(yǎng)基清洗以去除乙醇。

3.如權(quán)利要求1所述的海洋無脊椎動物細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(2)中，所述的一級培養(yǎng)基的配方為：

4.如權(quán)利要求1所述的海洋無脊椎動物細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(2)中，在酶解消化前將組織樣品進(jìn)行無菌剪碎，所述的酶解消化是在常溫下采用胰酶對剪碎后的組織樣品進(jìn)行消化。

5.如權(quán)利要求4所述的海洋無脊椎動物細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的酶解消化包括：向一級培養(yǎng)基中加入0.1-0.25％的胰酶溶液，胰酶溶液與一級培養(yǎng)基的體積比為1:(0.5-2)，酶解消化時間為5-60min。

6.如權(quán)利要求1所述的海洋無脊椎動物細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(3)中，所述的預(yù)培養(yǎng)包括：向原代細(xì)胞懸液中加入二級培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)12h，以24h為周期更換二級培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)一周。

7.如權(quán)利要求1所述的海洋無脊椎動物細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(3)中，所述的二級培養(yǎng)基的配方為：

8.如權(quán)利要求1所述的海洋無脊椎動物細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(4)中，預(yù)培養(yǎng)一周后更換三級培養(yǎng)基進(jìn)行后培養(yǎng)。

9.如權(quán)利要求1所述的海洋無脊椎動物細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(4)中，所述的三級培養(yǎng)基的配方為：

10.如權(quán)利要求1-9中任意一項(xiàng)所述的海洋無脊椎動物細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，先采用0.22μm濾膜對一級培養(yǎng)基、二級培養(yǎng)基、三級培養(yǎng)基進(jìn)行過濾除菌后再使用。