[發明專利]一種氨基酸脫氫酶突變體及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201810675947.0
• 申請日: 2018-06-27
• 公開（公告）號: CN108795893B
• 公開（公告）日: 2021-10-08
• 發明（設計）人: 盧江平;張娜;焦學成;李瑞;張克儉;張瑜;楊益明
• 申請（專利權）人: 凱萊英醫藥集團（天津）股份有限公司
• 主分類號: C12N9/06
• 分類號: C12N9/06;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟

本發明涉及基因工程技術領域，尤其涉及一種氨基酸脫氫酶突變體及其制備方法和應用，所述氨基酸脫氫酶突變體具有(I)、(II)所示的氨基酸序列中任意一個：(I)與SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列；(II)與SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的41至301位氨基酸經修飾、取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸獲得的氨基酸序列；所述取代為取代1?15個氨基酸；其中，所述突變體具有氨基酸脫氫酶的活性。本發明中通過設計41至301位氨基酸的多個不同位點的突變，發現這些突變體提高了氨基酸脫氫酶的催化活性，還可以降低氨基酸脫氫酶的使用量。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，尤其涉及一種氨基酸脫氫酶突變體及其制備方法和應用。

背景技術

氨基酸是至少有一個羧基和一個氨基的兩性化合物，按照氨基酸的存在方式，可以分為天然氨基酸和非天然氨基酸兩類，天然氨基酸是自然界中存在的氨基酸，非天然氨基酸是由人工合成的氨基酸，一般是在天然氨基酸的側鏈上引入一些基團以優化其性能。氨基酸及其衍生物因為其特殊的結構的性質在農業，工業，化工，食品，醫藥等方面有著廣泛的應用。光學活性的非天然氨基酸是一些生物活性肽的手性合成單元，也是許多藥物和精細化學品的重要中間體。

由酮酸經過不對稱還原氨化制備氨基酸是非天然氨基酸生產的重要方法，CN104016872A公開了一種手性α-非天然氨基酸的合成方法，在鈀催化劑、氧化劑作用下進行反應生成α-非天然氨基酸；CN101759601A公開了利用過渡金屬配合物制備手性α-非天然氨基酸的方法，該發明采用金屬絡合劑代替強酸性體系進行解絡合，可以用于合成側鏈含有對酸敏感基團的手性α-非天然氨基酸；與上述化學法相比，酶催化方法具有反應條件溫和，反映過程不需要有機溶劑，不需要添加金屬催化，立體選擇性較高等優點。

苯丙氨酸脫氫酶催化天然氨基酸苯丙氨酸的氧化脫氨或還原氨化。然而對于苯環上取代的非天然氨基酸催化效率很低，酶的使用量很大。一般而言，可以通過定向進化的手段對野生型酶進行改造，提高酶的各種性質，從而可以應用在生產中。

發明內容

針對現有技術的不足及實際的需求，本發明提供一種氨基酸脫氫酶突變體及其制備方法和應用，所述氨基酸脫氫酶突變體，提高了其轉化效率，穩定性，有利于其在制藥領域中的應用。

為達此目的，本發明采用以下技術方案：

第一方面，本發明提供一種氨基酸脫氫酶突變體，其具有(I)、(II)所示的氨基酸序列中任意一個：

(I)與SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列；

(II)與SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的41至301位氨基酸經修飾、取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸獲得的氨基酸序列；

所述取代為取代1-15個氨基酸；

其中，所述突變體具有氨基酸脫氫酶的活性。

本發明中，發明人通過設計41至301位氨基酸的多個不同位點的突變，從而對氨基酸脫氫酶的性質進行考察，發現這些位點的突變會提高氨基酸脫氫酶的活性，還可以降低酶的使用量，發明人進一步發現，通過在41至301位氨基酸的多個不同位點的突變，可以提高氨基酸脫氫酶的酶活至少1倍以上。

本發明中，所述SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列如下：