[發(fā)明專利]一種無飼養(yǎng)層無血清培養(yǎng)小鼠精原干細(xì)胞的體系及方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810673342.8
• 申請(qǐng)日: 2018-06-25
• 公開（公告）號(hào): CN109055306A
• 公開（公告）日: 2018-12-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 白銀山;朱翠;劉珊珊;馮美瑩;詹小舒;王丙云
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院
• 主分類號(hào): C12N5/076
• 分類號(hào): C12N5/076
• 代理公司: 廣東廣信君達(dá)律師事務(wù)所 44329
• 代理人: 楊曉松

本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，涉及小鼠精原干細(xì)胞(SSCs)的無飼養(yǎng)層無血清的培養(yǎng)體系的一種方法，本發(fā)明通過多聚賴氨酸處理培養(yǎng)材料，增加小鼠SSCs貼壁能力，通過制作Mef細(xì)胞上清液，作為添加劑以增加SSCs體外自我更新的促進(jìn)作用。本發(fā)明通過大量實(shí)驗(yàn)優(yōu)化建立的方法有效的促進(jìn)了小鼠SSCs無飼養(yǎng)層和無血清條件下體外增殖，其生長(zhǎng)速度和在飼養(yǎng)層細(xì)胞上生長(zhǎng)速度接近，維持了精原干細(xì)胞特征性的形態(tài)和標(biāo)志性基因表達(dá)，干性相關(guān)基因維持了較高的表達(dá)水平，這說明利用這種方法切實(shí)可以實(shí)現(xiàn)小鼠SSCs無飼養(yǎng)層和無血清培養(yǎng)；由于操作步驟簡(jiǎn)單，重復(fù)性高。本發(fā)明建立的小鼠生殖干細(xì)胞無飼養(yǎng)層培養(yǎng)方案，容易操作和推廣。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)研究技術(shù)領(lǐng)域，涉及小鼠精原干細(xì)胞體外培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因操作。

背景技術(shù)

精原干細(xì)胞(spermatogonial stem cells,SSCs)是一類存在于雄性動(dòng)物體睪丸內(nèi)生精小管內(nèi)側(cè)壁的一類維持增殖和分化平衡的成體干細(xì)胞，在體外培養(yǎng)過程中，SSCs可以自發(fā)表觀重組轉(zhuǎn)變成為具有和胚胎干細(xì)胞類似生物學(xué)功能的多能干細(xì)胞。是成體干細(xì)胞研究的一個(gè)重點(diǎn)。

國(guó)外早已成功建立嚙齒動(dòng)物SSCs長(zhǎng)期的培養(yǎng)體系(Falciatori et al.,2008；Hamra et al.,2005；Ogawa et al.,2004；Shen et al.,2008)，且這些培養(yǎng)體系中基本上含有飼養(yǎng)層，而且除嚙齒動(dòng)物外，其他物種和人的SSCs長(zhǎng)期培養(yǎng)還未成功，所以小鼠SSCs成為生殖干細(xì)胞研究主要細(xì)胞材料和模型；SSCs培養(yǎng)體系要求苛刻，需要添加大量因子和添加劑，但仍然很難體外維持培養(yǎng)，成為SSCs研究的主要瓶頸之一；此外SSCs轉(zhuǎn)基因也是非常困難工作，常規(guī)細(xì)胞轉(zhuǎn)基因方法很難在SSCs中應(yīng)用，因?yàn)榇嬖陲曫B(yǎng)層細(xì)胞，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因效率低，穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系篩選困難，成為SSCs生物學(xué)性質(zhì)研究的另一個(gè)重要制約因素。

在長(zhǎng)期的研究中，小鼠SSCs的培養(yǎng)方案日益完善，小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouseembryonic fibroblast cells,Mef)飼養(yǎng)層，可以分泌大量因子和外泌體等，是支持小鼠SSCs體外長(zhǎng)期自我更新的重要原因，是研究小鼠SSCs實(shí)驗(yàn)室獲得成功培養(yǎng)的一個(gè)重要材料；無飼養(yǎng)層和無血清的培養(yǎng)成為研究SSCs的一項(xiàng)迫切的技術(shù)之一；無飼養(yǎng)層培養(yǎng)對(duì)于小鼠SSCs轉(zhuǎn)基因操作中具有重要促進(jìn)作用，減少M(fèi)ef在轉(zhuǎn)基因和藥物篩選中的干擾；此外，無飼養(yǎng)層培養(yǎng)還可以減少操作步驟，減少因Mef質(zhì)量而造成小鼠SSCs的影響等；對(duì)于提高SSCs轉(zhuǎn)基因效率和穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的建立，具有重要意義，是小鼠SSCs生物學(xué)性質(zhì)研究提供重要手段。

2014年日本學(xué)者采用添加層粘連蛋白替代飼養(yǎng)層細(xì)胞，建立小鼠SSCs體外無飼養(yǎng)層培養(yǎng)的方案(Kanatsu-Shinohara M,Ogonuki N,Matoba S,et al.Improved serum-andfeeder-free culture of mouse germline stem cells[J].Biol Reprod.2014,91(4):88.)；同時(shí)韓國(guó)學(xué)者采用基質(zhì)膠處理的培養(yǎng)皿方法進(jìn)行無飼養(yǎng)層培養(yǎng)SSCs，建立無飼養(yǎng)層培養(yǎng)的小鼠SSCs的方法(Choi N Y,Park Y S,Ryu J S,et al.A novel feeder-freeculture system for expansion of mouse spermatogonial stem cells[J].MolCells.2014,37(6):473-479.)。本發(fā)明建立的方案和上述研究是不同的，結(jié)果也成功實(shí)現(xiàn)了小鼠SSCs無飼養(yǎng)層和無血清的長(zhǎng)期培養(yǎng)，所以具有創(chuàng)新性。

發(fā)明內(nèi)容

基于此，為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)小鼠精原干細(xì)胞的培養(yǎng)體系及方法。

本發(fā)明的目的在于建立一種無飼養(yǎng)層無血清小鼠SSCs培養(yǎng)方案。

本發(fā)明的目的還在于促進(jìn)小鼠SSCs無飼養(yǎng)層條件下長(zhǎng)期維持自我更新。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案：