[發明專利]一種帕金森病致病基因突變篩查檢測方法

在審

• 申請號: 201810671447.X
• 申請日: 2018-06-26
• 公開（公告）號: CN108660194A
• 公開（公告）日: 2018-10-16
• 發明（設計）人: 郭紀鋒;唐北沙;嚴新翔
• 申請（專利權）人: 中南大學湘雅醫院
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858
• 代理公司: 北京華仲龍騰專利代理事務所(普通合伙) 11548
• 代理人: 李靜

1.一種帕金森病致病基因突變篩查檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)將合成的MIPs探針，加dd H2O配成濃度為100μM的探針溶液，在-20℃溫度下儲存備用；

(2)使用移液器吸取(1)中每條探針溶液1μl，置于1.5ml的新EP管中，充分混勻，在管壁使用Marker筆標記為mixed-MIPs；

(3)配置MIPs探針磷酸化激活體系，將mixed-MIPs進行激活；

反應體系如下：25μl的mixed-MIPs、3μl的T4Polynucleotide Kinase、1μl的T4PNK、1μl的dd H2O、30μl的Total，

反應條件如下：37℃，45min→65℃，20min→4℃；

(4)mixed-MIPs探針稀釋：使用移液器吸取(3)中已磷酸化激活的mixed-MIPs探針混合液1μl加至新1.5ml EP管中，加99μl dd H2O，混合均勻，稀釋成100倍的pooled-MIPs，4℃保存備用；

(5)配制MIPs靶向捕獲反應體系：10μl的DNA(10ng/μl)、2.5μl的10x Ampligase DNAligase reaction Buffer、0.01μl的、Ampligase DNA ligase、0.03μl的dNTP(0.25mM)、0.32μl的Hemo Klentaq、0.1μl的pooled-MIPs、25μl的dd H2O，

MIPs靶向捕獲反應條件：95℃，10min→60℃，22h→10℃；

(6)配制MIPs酶切反應體系：0.5μl的Exonuclease I、0.5μl的Exonuclease III、0.2μl的10×Ampligase Buffer、0.8μl的dd H2O、25μl的MIPs靶向捕獲產物，

酶切反應條件：37℃，60min→95℃，3min→4℃；

(7)PCR擴增反應

步驟(6)中產物為MIPs探針-靶向捕獲區域的單鏈環狀DNA分子，作為本步驟的模板進行PCR擴增，通過PCR反應將目標捕獲序列進行擴增，并通過攜帶標簽序列(index)反向引物，對不同樣本進行標記，以便對不同樣本的測序數據進行區分、識別；

PCR擴增反應體系：12.5μl的Q5High Fidelity 2×Master Mix、0.125μl的Forwardprimer(100μM)、1.25μl的Reverse primer(10μM)、5μl的酶切反應體系、25μl的dd H2O，

PCR擴增反應條件：98℃，30s→98℃，10s

↙↖21循環

60℃，30s→72℃，30s→72℃，2min→4℃；

(8)聚丙烯酰胺凝膠電泳與磁珠純化

利用6％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，取步驟(7)的PCR擴增產物，進行產物鑒定，保證產生的文庫無差錯；

(9)混合文庫進行高通量測序

運用Illumina HiSeq 3000高通量測序平臺，對(8)中構建的文庫，進行Paired-end150bp測序，并對測序數據進行生物信息學分析；

(10)Sanger測序驗證

針對選定的變異位點進行PCR擴增引物設計，并進行PCR反應擴增，對擴增產物進行Sanger測序，驗證高通量測序篩選的堿基改變的準確性，排除高通量測序造成的假陽性可能。

2.根據權利要求1所述的一種帕金森病致病基因突變篩查檢測方法，其特征在于，還包括生物樣本，所述生物樣本為體液，所述體液包括但不限于：血液、血清、羊水、淋巴液。

3.根據權利要求2所述的一種帕金森病致病基因突變篩查檢測方法，其特征在于，所述體液為血液。

4.根據權利要求1所述的一種帕金森病致病基因突變篩查檢測方法，其特征在于，在所述聚合酶鏈擴增反應使用的引物對為：SEQ ID NO:6。