[發明專利]一種高效生產苯丙酮酸的方法

有效

• 申請號: 201810670959.4
• 申請日: 2018-06-26
• 公開（公告）號: CN108841844B
• 公開（公告）日: 2022-09-06
• 發明（設計）人: 劉佳;吳靜;楊彬;陳修來;羅秋玲
• 申請（專利權）人: 江南大學;無錫宸明生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N9/80;C12N1/21;C12N15/70;C12P7/40
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

本發明公開了一種高產苯丙酮酸的方法，屬于生物工程技術領域。本發明通過構象動力學工程方法改造奇異變形桿菌來源的氨基酸脫氨酶，改造后的氨基酸脫氨酶基因連接于pET 20b載體，在E.coli BL21(DE3)中表達。發酵罐培養重組菌株，收集濕菌體轉化丙氨酸生產苯丙酮酸，當濕菌體添加量30g/L，轉化12h苯丙酮酸產量可以達到72.5g/L，苯丙氨酸的摩爾轉化率達到96.7％。

技術領域

本發明涉及一種高產苯丙酮酸的方法，屬于生物工程技術領域。

背景技術

苯丙酮酸(PPA)是一種雙羥基化合物，分子式為C₉H₈O₃，結構式如圖1。PPA常用于醫藥、輕工和化工等領域，可以用于制作復方α酮酸片；PPA是合成D-苯丙氨酸的原材料，D-苯丙氨酸是手性藥物和食品添加劑的合成中間體；PPA還可以用于制備苯乳酸，苯乳酸可以用于抗菌防腐和風味添加劑。

PPA作為一種多功能有機酸，目前主要使用化學合成法生產，通常有α-乙酞氨基肉桂酸水解、乙內酰脲與苯甲醛合成法和氯芐經雙羥基化反應三條路線。α-乙酰氨基肉桂酸水解制備苯丙酮酸的方法，其合成路線是甘氨酸先制成乙酰甘氨酸，再和苯甲醛縮合，生成的內酯，水解后得乙酰氨基肉桂酸，酸化得苯丙酮酸，產品得率只有50％，該法工藝成熟，設備簡單，但由于在內酯合成苯甲醛和醋酐有一部分發生Perkin反應，產生肉桂酸副產物，苯甲醛部分聚合產生油性雜質造成內酯分離困難，導致該方法生產成本高。乙內酰脲與苯甲醛合成法在含有少量氨基酸的水溶液中，苯甲醛和乙內酰脲縮合成亞芐基乙內酰脲，然后用堿液水解生成的亞苯基乙酰脲而得苯丙酮酸鈉，原料易得，價格低廉，但是反應溫度在100℃左右，且排放大量工業廢水。雙羰基化法合成苯丙酮酸一般是以氯芐為原料，在過渡金屬絡合物催化作用下，以Ca、Mg、Ba等堿土金屬的弱堿為中和劑，在弱極性溶劑中與一氧化碳反應而得到，此反應需要在高壓條件下進行，設備投資大，反應時間長。化學合成法反應條件要求高，產品的的得率低，且會產生有毒有害物質，因此找到高效綠色的生產方法受到廣泛關注。

PPA的生物法生產可以采用直接發酵法和酶轉化法生產。根據文獻報道，魯氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii)、普通變形桿菌(Proteus vulgaris)、谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)和摩氏摩根菌(Morganella morganli)可以直接發酵生產PPA，其中P.vulgaris通過分批發酵產量可以達到3.0g/L。由于菌體內PPA的路徑較長，代謝路徑酶活低，直接發酵法PAA產量低，且發酵液中含有大量菌體、蛋白質、無機鹽等雜質，PPA的下游分離純化工藝復雜。酶轉化法可以利用苯丙氨酸脫氫酶、氨基酸轉移酶和和L-氨基酸脫氨酶轉化L-苯丙氨酸生產苯丙酮酸。

目前報道產量最高的是在大腸桿菌BL21中異源表達奇異變形桿菌(Proteusmirabilis)來源的L-氨基酸脫氨酶，使用全細胞轉化PPA產量可以達到58.4g/L。

發明內容

為了解決上述問題，本發明旨在通過基因工程手段改造氨基酸脫氨酶，提高PPA的生產能力，縮短轉化周期，減少濕細胞的添加量可以進一步降低PPA的生產成本。本發明提供了一種通過構象動力學工程改造得到高酶活力氨基酸脫氨酶的方法，并應用基因工程菌株全細胞轉化生產苯丙酮酸的方法，該方法濕菌體用量少、生產強度大、轉化效率高，適用于工業化生產苯丙酮酸。

本發明的第一個目的是提供一種氨基酸脫氨酶的突變體，所述突變體的氨基酸序列含有如SEQ ID NO:4所示。

本發明的第二個目的是提供編碼上述氨基酸脫氨酶突變體的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本發明的第三個目的是提供含有所述基因的表達載體。

本發明的第四個目的是提供一種基因工程菌，所述基因工程菌表達本發明的氨基酸脫氨酶突變體。