[發明專利]一種sRNA干擾體系在甲基菌中的構建方法

在審

• 申請號: 201810670151.6
• 申請日: 2018-06-26
• 公開（公告）號: CN108753675A
• 公開（公告）日: 2018-11-06
• 發明（設計）人: 朱麗萍;楊松
• 申請（專利權）人: 青島農業大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/65;C12N15/74;C12R1/01
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

本發明公開了一種sRNA干擾體系在甲基菌中的構建方法，首先利用轉座酶將p15A質粒插入M.extorquens AM1和PA1中；sRNA干擾體系元件的擴增及載體構建；再進行目的基因的干擾及菌株篩選，最后熒光蛋白標記載體的構建及熒光蛋白基因的表達鑒定。本發明通過抑制競爭旁路代寫途徑的表達，優化代謝產物流，提高目標產物的表達水平。高效的基因表達技術對于次級代謝產物產量的優化提高有重要意義，可廣泛應用于提高某種代謝產物產量研究。

技術領域

本發明屬于微生物技術領域，涉及一種sRNA干擾體系在甲基菌中的構建方法。

背景技術

Methylobacterium extorquens(M.extorquens)AM1是一類甲基營養細菌，能夠利用甲醇等一碳化合物作為唯一碳源合成高附加值的多碳有機物，具有很好的遺傳代謝背景；但是其遺傳操作手段相對單一，制約了外源生物合成途徑的多元修飾改造。在已報導的外源基因高效表達的遺傳操作手段中，常見的有核外高拷貝質粒表達的形式、以同源重組至染色體的方式、以及敲除競爭抑制途徑的方式等，但是甲基營養菌由于其胞外多糖的干擾和核外復制質粒種類的限制，使得傳統的基因工程操作技術過程與步驟繁瑣耗時。

發明內容

本發明的目的在于提供一種sRNA干擾體系在甲基菌中的構建方法，本發明在AM1菌中引入sRNA(small RNA，)干擾技術，對AM1中通用質粒pCM80質粒進行了不必要的基因片段的刪減，優化該質粒。通過抑制競爭旁路代寫途徑的表達，優化代謝產物流，提高目標產物的表達水平。高效的基因表達技術對于次級代謝產物產量的優化提高有重要意義，可廣泛應用于提高某種代謝產物產量研究。

本發明所采用的技術方案是按照以下步驟進行：

步驟1,利用轉座酶將p15A質粒插入M.extorquens AM1中；

步驟2，sRNA干擾體系元件的擴增及載體構建；

步驟3，目的基因的干擾及菌株篩選。

步驟4，熒光蛋白標記載體的構建及熒光蛋白基因的表達鑒定。

進一步，步驟2中sRNA干擾體系元件的擴增及載體構建方法，首先分別選取了大腸桿菌E.coli、甲基菌M.extorquens AM1和PA1來源的三種不同的Hfq蛋白基因hfqE、hfqA、hfqP，分別與MicC scaffold相連，克隆到出發載體pCM80上，設計針對靶基因lacZ的24bp的sRNA片段連接到上述三個載體之上，最終構建成用于sRNA干擾的載體pCM80-zmic-hfqA、pCM80-zmic-hfqE、pCM80-zmic-hfqP。

進一步，步驟3中目的基因的干擾及菌株篩選方法是將構建的sRNA載體轉入帶有LacZ基因的菌株AM1和PA1中，利用藍白斑現象篩選目的菌株，并進行干擾效率的統計，篩選最優的sRNA干擾元件組合。

進一步，步驟4中首先將不同來源的熒光蛋白基因克隆到pCM80載體上，轉化至甲基營養菌中，再將其克隆到sRNA干擾載體中，完成構建過程。

附圖說明

圖1是重組菌株的差異示意圖。

具體實施方式

下面結合具體實施方式對本發明進行詳細說明。

發明材料：菌株：M.extorquens AM1、M.extorquens PA1、E.coli

實驗試劑：培養基、抗生素(Tet、Km)、X-Gal、無菌水、實驗用品試劑盒、各種酶試劑等。

實驗器材：PCR儀、電轉儀、紫外線分光光度計、高壓滅菌鍋、高分辨率的熒光成像顯微鏡儀器、恒溫培養箱、搖床、水浴鍋、超凈工作臺等。

實驗方法：