[發明專利]一種sRNA干擾體系在甲基菌中的構建方法在審
| 申請號： | 201810670151.6 | 申請日： | 2018-06-26 |
| 公開（公告）號： | CN108753675A | 公開（公告）日： | 2018-11-06 |
| 發明（設計）人： | 朱麗萍;楊松 | 申請（專利權）人： | 青島農業大學 |
| 主分類號： | C12N1/21 | 分類號： | C12N1/21;C12N15/65;C12N15/74;C12R1/01 |
| 代理公司： | 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350 | 代理人： | 湯東鳳 |
| 地址： | 266109 山*** | 國省代碼： | 山東;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 構建 次級代謝產物 基因表達技術 熒光蛋白標記 熒光蛋白基因 表達水平 代謝產物 菌株篩選 目標產物 目的基因 載體構建 重要意義 產物流 轉座酶 擴增 旁路 質粒 代謝 優化 應用 研究 | ||
1.一種sRNA干擾體系在甲基菌中的構建方法，其特征在于按照以下步驟進行：
步驟1,利用轉座酶將p15A質粒插入M.extorquens AM1中；
步驟2，sRNA干擾體系元件的擴增及載體構建；
步驟3，目的基因的干擾及菌株篩選。
步驟4，熒光蛋白標記載體的構建及熒光蛋白基因的表達鑒定。
2.按照權利要求1所述一種sRNA干擾體系在甲基菌中的構建方法，其特征在于：所述步驟2中sRNA干擾體系元件的擴增及載體構建方法，首先分別選取了大腸桿菌E.coli、甲基菌M.extorquens AM1和PA1來源的三種不同的Hfq蛋白基因hfqE、hfqA、hfqP，分別與MicCscaffold相連，克隆到出發載體pCM80上，設計針對靶基因lacZ的24bp的sRNA片段連接到上述三個載體之上，最終構建成用于sRNA干擾的載體pCM80-zmic-hfqA、pCM80-zmic-hfqE、pCM80-zmic-hfqP。
3.按照權利要求1所述一種sRNA干擾體系在甲基菌中的構建方法，其特征在于：所述步驟3中目的基因的干擾及菌株篩選方法是將構建的sRNA載體轉入帶有LacZ基因的菌株AM1和PA1中，利用藍白斑現象篩選目的菌株，并進行干擾效率的統計，篩選最優的sRNA干擾元件組合。
4.按照權利要求1所述一種sRNA干擾體系在甲基菌中的構建方法，其特征在于：所述步驟4中首先將不同來源的熒光蛋白基因克隆到pCM80載體上，轉化至甲基營養菌中，再將其克隆到sRNA干擾載體中，完成構建過程。
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