[發(fā)明專利]一種人類酒精代謝能力基因突變位點的檢測方法及試劑盒在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201810669169.4 | 申請日： | 2018-06-26 |
| 公開（公告）號： | CN108977499A | 公開（公告）日： | 2018-12-11 |
| 發(fā)明（設計）人： | 王文忠;胡軍;田軍龍;陳蘇平;卜云璇 | 申請（專利權(quán)）人： | 蘇州道爾盾基因科技有限公司 |
| 主分類號： | C12Q1/6806 | 分類號： | C12Q1/6806;C12Q1/6872;C12Q1/6883 |
| 代理公司： | 北京遠大卓悅知識產(chǎn)權(quán)代理事務所(普通合伙) 11369 | 代理人： | 韓飛 |
| 地址： | 215000 江蘇省蘇州*** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 基因突變位點 酒精代謝 檢測 位點 特異性引物 乙醇脫氫酶 乙醛脫氫酶 檢測試劑 試劑盒 特異性PCR擴增 單堿基延伸 實驗自動化 質(zhì)譜儀檢測 目的片段 人員操作 實驗流程 脫鹽純化 位點設計 核酸 擴增 酶切 通量 重性 消化 基因 分析 | ||
1.一種人類酒精代謝能力基因突變位點的檢測方法，其特征在于，所述檢測方法包括如下步驟：
(1)針對乙醇脫氫酶ADH1B基因rs1229984位點和乙醛脫氫酶ALDH2基因rs671位點設計特異性引物；
(2)利用特異性PCR擴增出包含乙醇脫氫酶ADH1B基因rs1229984位點和乙醛脫氫酶ALDH2基因rs671位點的目的片段；
(3)利用限制性內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物片段；
(4)進行單堿基延伸反應；
(5)進行脫鹽純化處理；
(6)通過核酸質(zhì)譜儀檢測分析目標基因乙醇脫氫酶ADH1B基因rs1229984位點和乙醛脫氫酶ALDH2基因rs671位點的序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人類酒精代謝能力基因突變位點的檢測方法，其特征在于，所述步驟(1)中設計的特異性引物包括用于擴增乙醇脫氫酶ADH1B基因rs1229984位點和乙醛脫氫酶ALDH2基因rs671位點基因的特異性引物對，所述特異性引物對包含一條乙醇脫氫酶乙醇脫氫酶ADH1B基因rs1229984位點的正向引物SEQ ID Nos：1，和一條乙醇脫氫酶ADH1B基因rs1229984位點的反向引物SEQ ID Nos：2，以及包含一條乙醛脫氫酶ALDH2基因rs671位點的正向引物SEQ ID Nos：3，和一條乙醛脫氫酶ALDH2基因rs671位點的反向引物SEQ IDNos：4。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人類酒精代謝能力基因突變位點的檢測方法，其特征在于，所述步驟(2)中特異性PCR擴增的反應程序為：98℃熱啟動，10分鐘；95℃變性，30秒；55℃退火，30秒；72℃延伸，30秒；擴增40個循環(huán)；72℃終延伸，5分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人類酒精代謝能力基因突變位點的檢測方法，其特征在于，所述步驟(3)中的限制性內(nèi)切酶進行消化處理條件為：37℃消化處理45分鐘，85℃加熱變性5分鐘，冰浴10分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人類酒精代謝能力基因突變位點的檢測方法，其特征在于，所述步驟(3)中的限制性內(nèi)切酶為蝦堿性磷酸酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人類酒精代謝能力基因突變位點的檢測方法，其特征在于，所述步驟(4)中單堿基延伸反應包括乙醇脫氫酶ADH1B基因rs1229984位點和乙醛脫氫酶ALDH2基因rs671位點的單堿基延伸引物，所述乙醇脫氫酶ADH1B基因rs1229984位點的單堿基延伸引物包含一條單堿基延伸引物SEQ ID Nos：5，所述乙醛脫氫酶ALDH2基因rs671位點的單堿基延伸引物包含一條單堿基延伸引物SEQ ID Nos：6。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人類酒精代謝能力基因突變位點的檢測方法，其特征在于，所述步驟(4)中單堿基延伸反應的反應程序為：95℃熱啟動，1分鐘；95℃變性，5秒；56℃退火，5秒；80℃延伸，5秒；擴增40個循環(huán)；72℃終延伸，3分鐘。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人類酒精代謝能力基因突變位點的檢測方法，其特征在于，所述步驟(6)的核酸質(zhì)譜檢測的具體步驟為：
(1)在樹脂板上鋪好待用樹脂，風干5-10分鐘；
(2)向樣本板的反應孔中加入待測的樣本，補充25ul ddH2O，用封口膜密封，3000轉(zhuǎn)/分鐘瞬時離心；
(3)除去封口膜，將樣本板倒扣在步驟(1)的樹脂板上固定，然后將樣本板和樹脂板一起翻轉(zhuǎn)，使風干的樹脂落入樣本板的反應孔內(nèi)，用封口膜密封，3000轉(zhuǎn)/分鐘瞬時離心；
(4)將樣本板置于旋轉(zhuǎn)器上慢速旋轉(zhuǎn)20分鐘，再3000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，然后點樣上機，用核酸質(zhì)譜儀進行檢測。
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