[發明專利]一種定量檢測牛奶中磺胺嘧啶、三聚氰胺和黃曲霉毒素B1的表面等離子體共振免疫方法

在審

• 申請號: 201810661826.0
• 申請日: 2018-06-25
• 公開（公告）號: CN109030422A
• 公開（公告）日: 2018-12-18
• 發明（設計）人: 蘇暉;崔政;閆安;翟俊輝;張騰
• 申請（專利權）人: 北京中龍益誠科技有限公司
• 主分類號: G01N21/552
• 分類號: G01N21/552;G01N33/53
• 代理公司: 北京華仲龍騰專利代理事務所(普通合伙) 11548
• 代理人: 李靜

1.一種定量檢測牛奶中磺胺嘧啶、三聚氰胺和黃曲霉毒素B1的表面等離子體共振免疫方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1、芯片的包被；在3片納米金生物芯片上分別滴加1mg/mL～2mg/mL的磺胺嘧啶-BSA溶液，1mg/mL～2mg/mL的三聚氰胺-BSA溶液，1mg/mL～2mg/mL的黃曲霉毒素B1-BSA溶液，37℃孵育1h，用去離子水沖洗，氮氣吹干；滴加脫脂奶粉進行封閉，37℃孵育1h，用去離子水沖洗，氮氣吹干，制備成磺胺嘧啶檢測芯片、三聚氰胺檢測芯片和黃曲霉毒素B1檢測芯片，備用；

S2、樣品前處理方法；取空白牛奶,加入甲醇，混勻，在4℃、10000rpm離心30min，去除上層油脂，在下層牛奶中加入大分子吸附劑，孵育0.5h，10000rpm離心30min，取上清；

S3、標準溶液的配制：分別準確稱取磺胺嘧啶，三聚氰胺、黃曲霉毒素B1,先用終體積10％的甲醇溶解樣品，再加0.01M終體積90％的PBS溶解配制成1mg/mL的標準儲備液；由1mg/mL的標準儲備液加0.01M PBS逐級稀釋得到不同梯度標準溶液；

S4、表面等離子共振方法檢測；

(1)磺胺嘧啶的檢測：將0ng/mL，12.5ng/mL，20ng/mL，50ng/mL，100ng/mL,的磺胺嘧啶的標準溶液與等體積的抗體溶液混合，37℃孵育0.5h，備用，使磺胺嘧啶的終濃度為0ng/mL，6.25ng/mL，10ng/mL，25ng/mL，50ng/mL。將包被好的芯片裝入SPR生化分析儀流通槽，通入0.01M PBS作為儀器運行緩沖液，將磺胺嘧啶標準溶液與抗體的混合液通入流通池中進行競爭免疫結合反應，記錄儀器的響應值(RU)，將標準品樣品濃度與所對應的儀器響應值(RU)做標準曲線，獲得磺胺嘧啶濃度與RU的線性方程；

(2)三聚氰胺的檢測：將0ng/mL，12.5ng/mL，25ng/mL，50ng/mL，100ng/mL，200ng/mL的三聚氰胺的標準溶液與等體積的抗體溶液混合，37℃孵育0.5h，備用，使三聚氰胺的終濃度為0ng/mL，6.25ng/mL，12.5ng/mL，25ng/mL，50ng/mL，100ng/mL。將包被好的芯片裝入SPR生化分析儀流通槽，通入0.01M PBS作為儀器運行緩沖液，將三聚氰胺標準溶液與的抗體的混合液通入流通池中進行競爭免疫結合反應，記錄儀器的響應值(RU)，將標準品樣品濃度與所對應的儀器響應值(RU)做標準曲線，獲得三聚氰胺濃度與RU的線性方程；

(3)、黃曲霉毒素B1的檢測：將0ng/mL，12.5ng/mL，25ng/mL，40ng/mL，100ng/mL的黃曲霉毒素B1的標準溶液與等體積的抗體溶液混合，37℃孵育0.5h，備用，使黃曲霉毒素B1的終濃度為0ng/mL，6.25ng/mL，12.5ng/mL，20ng/mL，25ng/mL。將包被好的芯片裝入SPR生化分析儀流通槽，通入0.01M PBS作為儀器運行緩沖液，將黃曲霉毒素B1的標準溶液與抗體的混合液通入流通池中進行競爭免疫結合反應，記錄儀器的響應值(RU)，將標準品樣品濃度與所對應的儀器響應值(RU)做標準曲線，獲得黃曲霉毒素B1濃度與RU的線性方程；

S5、再生：用再生液分別洗脫磺胺嘧啶檢測芯片、三聚氰胺檢測芯片和黃曲霉毒素B1檢測芯片的表面結合的抗體，實現三種芯片的再生，用0.01M PBS沖洗至基線穩定，進行下一次測定；

S6、定量分析檢測牛奶樣品中的有害物：分別將一定量磺胺嘧啶、三聚氰胺、黃曲霉毒素B1添加到牛奶中，按照步驟S2的方法進行樣品前處理，按照步驟S4的方法對實際樣品進行檢測，記錄儀器響應值(RU)，通過步驟S4所得到的線性方程，換算出牛奶樣品中的實際濃度，實現對牛奶中的有害物的定量檢測。

2.根據權利要求1一種定量檢測牛奶中磺胺嘧啶、三聚氰胺和黃曲霉毒素B1的表面等離子體共振免疫方法，其特征在于，步驟S1中，所述磺胺嘧啶-BSA溶液，三聚氰胺-BSA溶液、黃曲霉毒素B1-BSA溶液的體積均為40μL，濃度均為1mg/mL，脫脂奶粉的體積為100μL，質量濃度(M/V)為4％。