[發(fā)明專利]一種干細(xì)胞源外泌體干預(yù)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810657212.5
• 申請(qǐng)日: 2018-06-22
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108865985A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-11-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 邵華;杜忠君;陳尚雅;賈強(qiáng);于功昌
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東省職業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病防治研究院
• 主分類號(hào): C12N5/0775
• 分類號(hào): C12N5/0775;C12N5/071
• 代理公司: 北京細(xì)軟智谷知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11471
• 代理人: 王金寶

1.一種干細(xì)胞源外泌體干預(yù)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

(1)分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；

(2)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的歸巢檢測(cè)；

(3)抽提骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞源外泌體；

(4)建立上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的體外模型；

(5)外泌體干預(yù)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干細(xì)胞源外泌體干預(yù)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于，分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞步驟中，取健康Wistar大鼠，3～5周齡，體重100～120g，75％酒精浸泡5min，取出后肢股骨和脛骨骨髓，將收獲的全部骨髓用注射器反復(fù)抽吸，以打散成細(xì)胞懸液；1000r.p.m離心10min，用完全培養(yǎng)基重懸沉淀的細(xì)胞；用完全培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞密度，然后將2×10⁶個(gè)骨髓細(xì)胞接種到50mL的塑料培養(yǎng)瓶中，將原代細(xì)胞置于CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；接種48h后，半量換液，之后每隔一天全量換液1次；待細(xì)胞生長(zhǎng)約90％細(xì)胞融合時(shí)，用0.25％胰蛋白酶消化傳代。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干細(xì)胞源外泌體干預(yù)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的歸巢檢測(cè)中，取SPF級(jí)雄性Wistar大鼠進(jìn)行矽肺模型造模，造模成功后24h經(jīng)尾靜脈注射BMSCs-GFP。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干細(xì)胞源外泌體干預(yù)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于，抽提骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞源外泌體步驟中，胎牛血清上清液離心去除細(xì)胞及其碎片，然后過(guò)濾上清液后，棄去上層，向下層中加入PBS，離心后，取沉淀，即得外泌體。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干細(xì)胞源外泌體干預(yù)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于，外泌體干預(yù)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化步驟中，包括外泌體對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)大鼠肺泡II型上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程的干預(yù)。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的干細(xì)胞源外泌體干預(yù)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于，外泌體對(duì)大鼠肺泡II型上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞干預(yù)步驟中，先建立上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的體外細(xì)胞模型，然后用外泌體干預(yù)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的干細(xì)胞源外泌體干預(yù)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于，建立上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的體外細(xì)胞模型中，將大鼠肺泡II型上皮細(xì)胞用胰酶-EDTA消化后接種于6孔板中，放置于37℃、5％C0₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；給予大鼠肺泡II型上皮細(xì)胞TGF-β1處理。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干細(xì)胞源外泌體干預(yù)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于，外泌體干預(yù)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化步驟中，外泌體染色后，將外泌體與TGF-β1處理后的大鼠肺泡II型上皮細(xì)胞共培養(yǎng)。