[發(fā)明專利]食品中霍亂弧菌、副溶血弧菌和擬態(tài)弧菌的檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810656021.7
• 申請(qǐng)日: 2018-06-23
• 公開（公告）號(hào): CN109055581A
• 公開（公告）日: 2018-12-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 邵楚瑤;劉瀅佳;陳曉旭
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 邵楚瑤
• 主分類號(hào): C12Q1/689
• 分類號(hào): C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/04;C12R1/63
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

一種食品中霍亂弧菌、副溶血弧菌和擬態(tài)弧菌的PCR檢測(cè)方法，其特征在于：其檢測(cè)步驟為：待檢測(cè)的樣品經(jīng)二次增菌后，采用水煮法提取弧菌基因組DNA，然后經(jīng)PCR反應(yīng)后，再經(jīng)電泳、染色、漂洗，最后用凝膠成像儀觀察結(jié)果并拍照，最后經(jīng)過譜圖分析即可得出檢測(cè)結(jié)果。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：可同時(shí)檢測(cè)食品中的霍亂弧菌、副溶血弧菌和擬態(tài)弧菌，可以在不影響檢出率的條件下加快檢測(cè)速度，減少工作量和檢測(cè)成本。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種食品中霍亂弧菌、副溶血弧菌和擬態(tài)弧菌的檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于致病性弧菌的檢測(cè)方法還是傳統(tǒng)的微生物學(xué)檢測(cè)方法，尚不夠完善，每種檢測(cè)方法僅能檢測(cè)一種致病性弧菌，而國(guó)外的傳統(tǒng)微生物學(xué)檢測(cè)方法(如FDA、AOAO、ISO等)也是以單一或少數(shù)目標(biāo)菌為目的設(shè)計(jì)的程序。因此，幾乎每檢測(cè)一種致病性弧菌都需配制不同的培養(yǎng)基和試劑，耗時(shí)又耗力。在分子生物學(xué)檢測(cè)方法方面，F(xiàn)DA2004標(biāo)準(zhǔn)仍是以檢測(cè)一種致病性弧菌為目的設(shè)計(jì)PCR程序，檢測(cè)不同的弧菌需要不同的反應(yīng)條件。國(guó)內(nèi)的檢測(cè)人員設(shè)計(jì)PCR檢測(cè)方法時(shí)也是以毒力基因?yàn)榇龜U(kuò)增序列，而且關(guān)注的大都是O1型和O139型霍亂弧菌與副溶血弧菌，PCR方法檢測(cè)創(chuàng)傷弧菌的報(bào)道只有2000年有過1例，擬態(tài)弧菌、至今仍未見到過。

除了常見的霍亂弧菌和副溶血弧菌外，許多國(guó)家已開始關(guān)注其它致病性弧菌在食物中的存在。目前，由于在水產(chǎn)品檢測(cè)中經(jīng)常是一份樣品同時(shí)檢測(cè)幾種致病性弧菌，因此，有必要研究一種方法，可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)致病性弧菌。這樣，可以在不影響檢出率的條件下加快檢測(cè)速度，減少工作量和檢測(cè)成本，以適應(yīng)加入WTO后的新的形勢(shì)需求，與國(guó)際方法接軌。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種食品中霍亂弧菌、副溶血弧菌和擬態(tài)弧菌的檢測(cè)方法，其優(yōu)點(diǎn)在于：可同時(shí)檢測(cè)以上三種致病性弧菌，在不影響檢出率的條件下加快檢測(cè)速度，減少工作量和檢測(cè)成本。

本發(fā)明所提供的食品中霍亂弧菌、副溶血弧菌和擬態(tài)弧菌的檢測(cè)方法，其特征在于：其檢測(cè)步驟為：待檢測(cè)的樣品經(jīng)二次增菌后，采用水煮法提取弧菌基因組DNA，然后經(jīng)PCR反應(yīng)后，再經(jīng)電泳、染色、漂洗，最后用凝膠成像儀觀察結(jié)果并拍照，最后經(jīng)過譜圖分析即可得出檢測(cè)結(jié)果。

本發(fā)明所提供的食品中霍亂弧菌、副溶血弧菌和擬態(tài)弧菌的檢測(cè)方法，采用霍亂弧菌的膠原酶基因(vcc，AE004243)、擬態(tài)弧菌的溶血素基因(vmh，VMU68271)和副溶血弧菌的不耐熱溶血毒素基因(tlh)為一組檢測(cè)霍亂弧菌、擬態(tài)弧菌和副溶血弧菌(三重PCR)，檢測(cè)出霍亂弧菌后再以vcc、霍亂腸毒素基因(ctx，AF516349)為一組確定霍亂弧菌是否具有霍亂腸毒素基因(V.c二重PCR)。其優(yōu)點(diǎn)在于：可同時(shí)檢測(cè)以上三種致病性弧菌，可以在不影響檢出率的條件下加快檢測(cè)速度，減少工作量和檢測(cè)成本。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明所提供的食品中霍亂弧菌、副溶血弧菌和擬態(tài)弧菌的檢測(cè)方法，其特征在于：其檢測(cè)步驟為：待檢測(cè)的樣品經(jīng)二次增菌后，采用水煮法提取弧菌基因組DNA，然后經(jīng)PCR反應(yīng)后，再經(jīng)電泳、染色、漂洗，接著用凝膠成像儀觀察結(jié)果并拍照，最后經(jīng)過譜圖分析即可得出檢測(cè)結(jié)果。

所述的二次增菌，包括第一次增菌和第二次增菌，所述的第一次增菌，其操作步驟為：在無菌條件下，取充分剪碎的樣品，加入盛有9倍量的3％的NaCl堿性蛋白胨水的滅菌容器內(nèi)，在37℃±3℃條件下培養(yǎng)4h～15h，所述的第二次增菌，其操作步驟為：吸取一定量第一次增菌的增菌液加入盛有9倍量的3％NaCl堿性蛋白胨水(APW)的滅菌試管內(nèi)，在37℃±3℃條件下培養(yǎng)4h～15h。

所述的水煮法提取弧菌基因組DNA，其操作步驟為：取培養(yǎng)的菌液加入離心管中，以13000rpm離心1min，棄上清液，然后加入0.6ml無菌去離子水懸浮沉淀，振蕩混勻后，96-100℃水浴10min，12000rpm離心5min，取上清液作為DNA模板，-20℃環(huán)境下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>