[發明專利]食品中霍亂弧菌、副溶血弧菌和擬態弧菌的檢測方法

在審

• 申請號: 201810656021.7
• 申請日: 2018-06-23
• 公開（公告）號: CN109055581A
• 公開（公告）日: 2018-12-21
• 發明（設計）人: 邵楚瑤;劉瀅佳;陳曉旭
• 申請（專利權）人: 邵楚瑤
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/04;C12R1/63
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種食品中霍亂弧菌、副溶血弧菌和擬態弧菌的檢測方法，其特征在于：其檢測步驟為：

(1)檢測的樣品經二次增菌：所述的二次增菌，包括第一次增菌和第二次增菌，所述的第一次增菌，其操作步驟為：在無菌條件下，取充分剪碎的樣品，加入盛有3％的NaCl堿性蛋白胨水的滅菌容器內，所述樣品與堿性蛋白胨水的用量為：每25克樣品加入225ml的堿性蛋白胨水，在37℃±3℃條件下培養4h～15h，所述的第二次增菌，其操作步驟為：吸取一定量第一次增菌的增菌液加入盛有9倍量的3％NaCl堿性蛋白胨水(APW)的滅菌試管內，所述增菌液與堿性蛋白胨水的用量為：每1ml增菌液加入9ml的堿性蛋白胨水，在37℃±3℃條件下培養4h～15h；

(2)水煮法提取弧菌基因組DNA：吸取1.5ml培養的菌液，加入1.5ml離心管中，以13000rpm離心1min，棄上清液，然后加入0.6ml無菌去離子水懸浮沉淀，振蕩混勻后，96-100℃水浴10min，12000rpm離心5min，取上清液作為DNA模板，-20℃環境下儲存備用；

(3)PCR反應：所述的PCR反應為先做三重PCR反應，檢出霍亂弧菌后再做V.c二重PCR反應：所述的三重PCR反應，其反應體系為：H2O：12.3μl，Buffer：2.6μl，dNTP：0.5μl，引物Pn：(0.4*6)μl，Taq酶：0.2μl，模板DNA：2.0μl，總體積為20μl，所述的V.c二重PCR反應，其反應體系為：H2O：12.5μl，Buffer：2.6μl，dNTP：0.5μl，Pvcc：(0.4*2)μl，Pctx：(0.7*2)μl，Taq酶：0.2μl，模板DNA：2.0μl，總體積為20μl；所述的PCR反應循環參數為：94℃預變性3min；然后94℃變性1min，60℃退火1min，72℃復性1min循環35次，最后72℃延伸7min；

(4)電泳：所述的電泳為瓊脂糖凝膠電泳，其操作步驟為：PCR反應結束后以98V電壓2.5％凝膠電泳90min；

(5)染色：所述的染色為在溴化乙錠溶液中染色20min；

(6)漂洗；

(7)用凝膠成像儀觀察結果并拍照，最后經過譜圖分析即可得出檢測結果，所述的譜圖分析包括陽性對照和陰性對照，對于譜圖中是否有相應特征位置條帶的出現，即可判別被檢測對象中是否有霍亂弧菌、副溶血弧菌和擬態弧菌的存在。