[發明專利]一種魚類過敏原小清蛋白的金磁酶聯免疫檢測方法

在審

• 申請號: 201810653655.7
• 申請日: 2018-06-22
• 公開（公告）號: CN108918877A
• 公開（公告）日: 2018-11-30
• 發明（設計）人: 王元鳳;孫登瑤;郭巖;費定文;趙妍;徐乃豐;魏新林
• 申請（專利權）人: 上海師范大學;上海交通大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577
• 代理公司: 上海科盛知識產權代理有限公司 31225
• 代理人: 褚明偉

本發明涉及一種魚類過敏原小清蛋白的金磁酶聯免疫檢測方法，利用金磁免疫探針與酶標抗原以及不同濃度的魚類小清蛋白進行混合，所述金磁免疫探針由金磁復合納米粒子與單克隆抗體組成，使其相互競爭單克隆抗體，一段時間后，使用磁塊使其磁性分離，使用TMB作為顯色底物，硫酸作為終止液終止反應，檢測不同濃度魚類小清蛋白混合下，混合上清液的吸光值；以抑制率(％)作為縱坐標，添加魚類小清蛋白濃度的對數值作為橫坐標，繪制標準曲線，通過OD值的測定，達到檢測待測樣品中過敏原小清蛋白含量的目的。與現有技術相比，與現有技術相比，本發明檢測體系可以提高檢測靈敏度和特異性，在食品安全檢測中有重要的實際應用價值。

技術領域

本發明涉及檢測過敏原的方法，尤其是涉及一種魚類過敏原小清蛋白的金磁酶聯免疫檢測方法。

背景技術

魚類是人類重要的食物來源，味道鮮美且營養豐富，新鮮魚肉中富含15％～20％的全價蛋白，1％～10％的脂肪，并富含不飽和脂肪酸，魚類含無機鹽1～2％，包括鈣、磷、鉀、銅、鋅、硒等。海魚含碘特別豐富，每Kg魚類含碘達500～1000μg，淡水魚含碘為50～400μg；魚類特別是魚肝含有極豐富的維生素A、維生素Bl、維生素B2、維生素D以及煙酸。我國是水產養殖大國,占世界養殖水產品產量的70％以上，淡水漁業總面積達1760萬公頃，占國土面積的1.8％。我國海關總署統計,2016年我國水產品進出口總量827.91萬噸，進出口總額301.12億美元。可見漁業的發展，給國家經濟帶來巨大的效益。

食物過敏也稱為食物變態反應或消化系統變態反應、過敏性胃腸炎等，是由于某種食物或食品添加劑等引起的IgE介導和非IgE介導的免疫反應，而導致消化系統內或全身性的變態反應。魚類是世界糧農組織指出的八大過敏原食物之一，因食用魚類導致過敏的事件時有發生,過敏疾病給廣大人群帶來的巨大的困擾。魚類過敏可導致患者出現皮膚紅腫、哮喘、鼻炎等過敏性癥狀，嚴重時還伴隨著虛脫、休克，甚至危及生命，嚴重影響著過敏人群的身體健康和生活質量。

魚類中的主要過敏原是PV，PV主要存在于魚的白色肉中，是一種鈣離子結合的酸性蛋白，分子大小大約在10～12Kd左右。魚類及其加工制品種類日益豐富，適用人群年齡范圍逐漸擴大。然而當下，對于小清蛋白的檢測還是停留在實驗研究階段，對于怎樣快速、方便、準確的檢測魚類過敏原PV對于人類來說則顯得越來越重要。目前，檢測魚類主要過敏原PV的手段有熒光標記抗體法(專利號：201210153421.9)、生物素標記抗體檢測法(專利號：201110196761.5)、快速免疫磁珠層析法(專利號：201010521189.0)、毛細管電泳檢測法(專利號：201610236444.4)。上述檢測手段操作繁瑣，例如：實時熒光PCR技術對操作人員技術要求較高同時易出現假陽性，毛細管電泳檢測法需要使用陰離子交換柱和電泳；有的檢測手段最低檢測限有待提高，例如：免疫磁珠層析法對PV的最低檢測限為0.16mg/mL。

發明內容

本發明的目的就是為了克服上述現有技術存在的缺陷而提供一種魚類過敏原小清蛋白的金磁酶聯免疫檢測方法。

本發明檢測方法具有高效、便捷、準確的特性，在實際現場快速檢測中具有重要意義。

本發明的目的可以通過以下技術方案來實現：

一種魚類過敏原小清蛋白的金磁酶聯免疫檢測方法，包括以下步驟：利用金磁免疫探針與酶標抗原以及不同濃度的魚類小清蛋白進行混合，所述金磁免疫探針由金磁復合納米粒子與單克隆抗體組成，使其相互競爭單克隆抗體，一段時間后，使用磁塊使其磁性分離，使用TMB作為顯色底物，硫酸作為終止液終止反應，檢測不同濃度魚類小清蛋白混合下，混合上清液的吸光值；

不同濃度的魚類小清蛋白與酶標抗原的競爭力不同，其抑制酶標抗原與金磁探針上抗體的結合的能力也不同。以抑制率(％)作為縱坐標，添加魚類小清蛋白濃度的對數值作為橫坐標，繪制標準曲線，通過OD值的測定，即可達到檢測待測樣品中過敏原小清蛋白含量的目的。

所述魚類小清蛋白的提取和純化的制備步驟：