[發明專利]一種魚類過敏原小清蛋白的金磁酶聯免疫檢測方法

在審

• 申請號: 201810653655.7
• 申請日: 2018-06-22
• 公開（公告）號: CN108918877A
• 公開（公告）日: 2018-11-30
• 發明（設計）人: 王元鳳;孫登瑤;郭巖;費定文;趙妍;徐乃豐;魏新林
• 申請（專利權）人: 上海師范大學;上海交通大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577
• 代理公司: 上海科盛知識產權代理有限公司 31225
• 代理人: 褚明偉

1.一種魚類過敏原小清蛋白的金磁酶聯免疫檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

利用金磁免疫探針與酶標抗原以及不同濃度的魚類小清蛋白進行混合，所述金磁免疫探針由金磁復合納米粒子與單克隆抗體組成，使其相互競爭單克隆抗體，一段時間后，使用磁塊使其磁性分離，使用TMB作為顯色底物，硫酸作為終止液終止反應，檢測不同濃度魚類小清蛋白混合下，混合上清液的吸光值；

以抑制率(％)作為縱坐標，添加魚類小清蛋白濃度的對數值作為橫坐標，繪制標準曲線，通過OD值的測定，達到檢測待測樣品中過敏原小清蛋白含量的目的。

2.根據權利要求1所述的一種魚類過敏原小清蛋白的金磁酶聯免疫檢測方法，其特征在于，所述魚類小清蛋白的提取和純化的制備步驟：

取魚肌肉絞成肉糜，采用熱抽提法，將其均質后以抽提液提取，離心，取上清煮沸，離心，取上清，加入飽和度60％硫酸銨溶液攪拌，靜置后離心，取上清加入飽和度100％硫酸銨攪拌，靜置后離心，取沉淀，最后將沉淀溶解于超純水中，透析過夜，得到魚類小清蛋白。

3.根據權利要求1所述的一種魚類過敏原小清蛋白的金磁酶聯免疫檢測方法，其特征在于，所述金磁復合納米粒子為Fe₃O₄-PEI-Au₁-PEI-Au₂，

是在Fe₃O₄-PEI的表面通過靜電吸附包被少量的Au顆粒，制備Fe₃O₄-PEI-Au₁復合納米微粒；重復以上反應吸附第二層金，即Fe₃O₄-PEI-Au₁-PEI-Au₂。

4.根據權利要求1所述的一種魚類過敏原小清蛋白的金磁酶聯免疫檢測方法，其特征在于，所述金磁免疫探針的制備方法為：

取金磁復合納米粒子溶于PBS緩沖液中，洗數遍，然后向其中加入單克隆抗體，震蕩反應，反應結束后吸取上清液，用PBST緩沖液洗三遍，加入3％BSA的PBS，封閉，PBST洗滌液沖洗后，溶于PBS緩沖液中，即得到所述金磁免疫探針。

5.根據權利要求1所述的一種魚類過敏原小清蛋白的金磁酶聯免疫檢測方法，其特征在于，所述單克隆抗體采用以下方法制備得到：

第一步，動物的免疫，初步得到免疫抗體，

第二步，細胞融合，雜交瘤細胞的篩選和純化，體外獲得產生抗體的細胞株，

第三步，腹水抗體的獲得，體內獲得最終單克隆抗體。

6.根據權利要求5所述的一種魚類過敏原小清蛋白的金磁酶聯免疫檢測方法，其特征在于，動物的免疫，初步得到免疫抗體采用以下方法：

使用純化后PV免疫雌性4-6周小鼠，每次100ug/只，第1次采用福氏完全佐劑，與蛋白液等體積混勻，后4次免疫采用福氏不完全佐劑，每2周免疫1次，測定小鼠血清效價，取免疫效果最佳者于融合前3d用，純化后PV蛋白尾腹腔注射加強免疫，免疫3次后，經尾靜脈采血測定血清中抗體效價，以便雜交瘤的培養、篩選。

7.根據權利要求5所述的一種魚類過敏原小清蛋白的金磁酶聯免疫檢測方法，其特征在于，細胞融合，雜交瘤細胞的篩選和純化，體外獲得產生抗體的細胞株的方法如下：

分別收集免疫小鼠脾細胞和SP2/0骨髓瘤細胞以約1：5的比例在50％聚乙二醇作用下誘導細胞融合，融合后的細胞沉淀用無血清培養液輕懸終止PEG的作用，離心，將細胞團輕懸于HAT選擇培養液中，鋪于96孔培養板，置于37℃，5％CO₂培養箱中培養，1周后顯微鏡下可觀察到細胞團，無菌條件下將培養板每孔的單個細胞團吸起放入96孔板HT培養液中，繼續培養，當96孔板中細胞長至視野1/3時，間接ELISA法進行檢測細胞上清效價，陽性孔用有限稀釋法進行亞克隆，連續三次亞克隆呈陽性的細胞孔進行擴大培養。