[發明專利]基于基因編輯技術增加SMN蛋白表達的方法及其在SMA治療中的應用

有效

• 申請號: 201810652815.6
• 申請日: 2018-06-22
• 公開（公告）號: CN110628814B
• 公開（公告）日: 2023-07-18
• 發明（設計）人: 陳萬金;楊輝;李錦晶;林翔;王檸
• 申請（專利權）人: 福建醫科大學附屬第一醫院;中國科學院上海生命科學研究院
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/90;C12N5/10;C12N15/113;A61K47/54;A61K38/46;A61K48/00;A61P21/00
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

本發明提供了基于基因編輯技術增加SMN蛋白表達的方法及其在SMA治療中的應用。增加SMN蛋白表達的方法是利用CRISPR/Cas9技術破壞SMN2的7號內含子上的剪接沉默子ISS?N1或ISS+100而實現的。本發明提供的增加SMN蛋白表達方法是從DNA層面改造，是一種行之有效、安全高效、經濟實用的方法。同時，本發明還提供了增加SMN蛋白新方法在SMA治療中的系列應用，包括基因編輯的特定sgRNA序列，基因編輯試劑，基因編輯質粒，基因編輯細胞及其制備方法，基因編輯動物制備方法，基因編輯藥物。

技術領域

本發明屬于基因工程領域，更具體地，本發明涉及基于基因編輯技術增加SMN蛋白表達的方法及其在SMA治療中的應用。

背景技術

脊髓性肌萎縮癥(Spinal?Muscular?Atrophy；SMA)是一種常染色體隱性遺傳病，主要累及脊髓前角，臨床上主要表現為四肢進行性萎縮及無力，死亡率及致殘率極高。在嬰幼兒致死性遺傳病中排名第一位，每6000名新生兒中就有一位發病。

SMA的致病基因是運動神經元生存基因(Survival?motor?neuron，SMN)，人類有兩種高度同源的SMN基因，分別為端粒側的SMN1和著絲粒側的SMN2，SMN1編碼全長的SMN蛋白為功能性SMN蛋白，而SMN2主要編碼截短的SMN蛋白。95％的SMA病人純合缺失SMN1基因，導致了SMN蛋白的缺乏，引起SMA相關的臨床癥狀。

SMN1與SMN2這兩個基因高度相似，最重要的差異點是位于7號外顯子上的c.840CT。這種差異導致SMN2在轉錄過程中7號外顯子大多被跳躍了(詳見圖1)，產生截短的蛋白，這種蛋白是低效能的，且很快被降解。有研究發現，在SMN2基因7號內含子中存在一個剪接沉默子(intronic?splicing?silencer，ISS)－N1即ISS-N1，這是造成7號外顯子跳躍的原因之一。另一個重要的剪接抑制元件為SMN2基因7號內含子的ISS+100，它由SMN2與SMN1在7號內含子的一個差異點導致(A100G)。2011年，美國冷泉港實驗室的研究人員設計了一種反義寡核苷酸(Antisense?oligonucleotides，ASO)SMN-Rx來掩蔽這個ISS-NI位點，從而能夠調節SMN2的剪接并提高SMN蛋白的表達。然而，其制備的ASO在細胞內會降解，功能性SMN蛋白的表達是短期的。以臨床SMA治療為例，維持SMN蛋白表達需要定期不斷補充ASO，這需要通過腰椎穿刺鞘內注射給藥，病人難以接受，這限制了該方法的相關應用。此外，目前的ASO在美國定價每人第一年高達75萬美金，以后每年37.5萬美金，需要一直治療價格高昂。

因此，亟需探究安全有效、經濟實用的增加SMN蛋白表達的方法，并探索其在SMN治療中的應用。

發明內容

本發明的目的在于提供一種利用基因編輯技術緩解或治療脊髓性肌萎縮癥的方法。

在本發明的第一方面，提供一種增加功能性SMN蛋白表達的方法，包括：利用CRISPR/Cas9技術破壞SMN2基因7號內含子上的剪接沉默子ISS-N1或ISS+100。

在一個優選例中，所述CRISPR/Cas9技術包括：采用的特定sgRNA靶向于SMN2基因7號內含子上的剪接沉默子ISS-N1或ISS+100；優選地，該特定sgRNA的序列如SEQ?ID?NO:1、SEQ?ID?NO:2或SEQ?ID?NO:3所示。

在另一優選例中，利用基于所述特定sgRNA的CRISPR/Cas9技術能在SMN2基因7號內含子上的剪接沉默子ISS-N1和/或ISS+100處引入隨機的插入或缺失或者插入和缺失；優選地，在ISS-N1的兩個調節區域CAG和AAAG中的至少一個引入插入、缺失、或插入和缺失的組合。

在另一優選例中，所述方法應用于人誘導性多能干細胞(hiPSCs)，包括：提供針對SMN2基因7號內含子上的剪接沉默子ISS-N1和/或ISS+100位點的sgRNA，構建靶向質粒，對hiPSC進行打靶，挑選出發生基因編輯的細胞株。