[發明專利]一種腫瘤樣品測序參考品的制備方法

有效

• 申請號: 201810652316.7
• 申請日: 2018-06-22
• 公開（公告）號: CN108728516B
• 公開（公告）日: 2022-06-14
• 發明（設計）人: 沈偉強;胡文瑋;孫春麗;田慧;焦海濤;史善甫;劉璐;葉佳慧;奚云;葛海鵬;陳悅科
• 申請（專利權）人: 安徽鼎晶生物科技有限公司;浙江紹興鼎晶生物醫藥科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6869
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 劉奇

本發明提供了一種腫瘤樣品測序參考品的制備方法，屬于高通量測序技術領域，所述方法包括以下步驟：對腫瘤細胞系進行單克隆培養獲得單克隆細胞系并提取全基因組；測定等位基因頻率測定；根據等位基因突變頻率與目標等位基因突變頻率確定稀釋倍數；用陰性細胞倍比稀釋所述單克隆細胞系獲得混合細胞；提取混合細胞的全基因組，測定等位基因突變頻率；根據混合細胞的等位基因突變頻率與目標等位基因突變頻率比較，細化倍比稀釋的倍數，用陰性細胞稀釋所述單克隆細胞系獲得參考品。本發明所述方法采用對細胞株單克隆結合高通量測序確定細胞系的基因背景；使用多步驟逐步細化的倍比稀釋法結合流式細胞儀對細胞精確計數，保證參考品制備的高度可重復性。

技術領域

本發明屬于高通量測序技術領域，尤其涉及一種腫瘤樣品測序參考品的制備方法。

背景技術

高通量測序不僅能夠明確判斷與疾病相關的基因是否發生變異而且能夠提供更多量化的信息，在臨床診斷應用上日益被人們所接受。但高通量測序技術的臨床應用仍然具有一定的挑戰性，其中診斷錯誤率高就是一個主要的問題，為了降低診斷錯誤率，人們在測序機器性能的升級、實驗方案的設計和生信分析流程等幾方面進行了不斷的努力，但是目前高通量測序的診斷錯誤率仍然較高。

造成這個現象的重要原因之一：測序過程中所用參考品的質量不足以滿足臨床檢測的要求，這一原因往往被忽視，由于缺乏高質量的參考品從而導致不同檢測實驗室、不同操作人員、不同測序平臺之間的結果無法進行科學系統的比較。高質量的參考品可以更好的解決這些問題，它可以標準化基因組的定性和定量參數，提高臨床診斷的準確性、可靠性和標準化，降低診斷錯誤率，使測序數據能夠提供準確且有診斷價值的結果。

一個合格的參考品需要對參考品量化、參考品的等位基因頻率和腫瘤相關突變情況有明確的數據；另外對于特定測序項目還需要做到能涵括所要檢測的變異類型，突變位點的具體頻率等信息。只有做到以上這些要求，才能做到對每次測序檢測的準確性和穩定性進行評估。簡而言之，測序參考品需要突變信息精確定義、精準量化，并且保證高度穩定。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種操作簡便且準確的腫瘤樣品高通量測序參考品的制備方法。

為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：一種腫瘤樣品測序參考品的制備方法，包括以下步驟：1)對腫瘤細胞系進行單克隆培養獲得單克隆細胞系；2)提取所述單克隆細胞系的全基因組；3)利用高通量測序對所述單克隆細胞系的全基因組進行等位基因頻率測定獲得等位基因突變頻率；4)根據步驟3)中獲得的等位基因突變頻率與目標等位基因突變頻率確定對單克隆細胞系的稀釋倍數；5)胰酶消化所述單克隆細胞系后，用流式細胞儀計數獲得單克隆細胞系的細胞濃度，以細胞數計，用相應數量的等位基因突變頻率為0的陰性細胞按照步驟4)中確定的稀釋倍數稀釋所述單克隆細胞系獲得混合細胞；6)提取步驟5)中所述混合細胞的全基因組，利用高通量測序對所述混合細胞的全基因組進行等位基因測定獲得混合細胞的等位基因突變頻率；7)將步驟6)中獲得的混合細胞的等位基因突變頻率與目標等位基因突變頻率比較，如混合細胞的等位基因突變頻率與目標等位基因突變頻率一致，則按照步驟4)中的稀釋倍數，用陰性細胞稀釋所述單克隆細胞系獲得參考品；若混合細胞的等位基因突變頻率與目標等位基因突變頻率不一致，則細化倍比稀釋的倍數；重復步驟5)和6)，直到混合細胞的等位基因突變頻率與目標等位基因突變頻率一致，按照此時的稀釋倍數，用陰性細胞稀釋所述單克隆細胞系獲得參考品。

優選的，所述腫瘤細胞系包括NCI-H1650，NCI-H1975，NCI-H23，NCI-H2087，HCT-15，LS 174T，SW1417或SW48。

優選的，步驟1)獲得單克隆細胞系后還包括篩選步驟；所述篩選為提取單克隆細胞系的全基因組，進行3～5次高通量測序獲得3～5個等位基因突變頻率，篩選等位基因突變頻率穩定的單克隆細胞系。

優選的，步驟4)中所述稀釋倍數為1.5～2.5倍。

優選的，步驟5)中所述陰性細胞為Hela細胞。