[發明專利]一種腫瘤樣品測序參考品的制備方法

有效

• 申請號: 201810652316.7
• 申請日: 2018-06-22
• 公開（公告）號: CN108728516B
• 公開（公告）日: 2022-06-14
• 發明（設計）人: 沈偉強;胡文瑋;孫春麗;田慧;焦海濤;史善甫;劉璐;葉佳慧;奚云;葛海鵬;陳悅科
• 申請（專利權）人: 安徽鼎晶生物科技有限公司;浙江紹興鼎晶生物醫藥科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6869
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 劉奇

1.一種腫瘤樣品測序參考品的制備方法，包括以下步驟：

1)對腫瘤細胞系進行單克隆培養，獲得單克隆細胞系；

2)提取所述單克隆細胞系的全基因組，并進行篩選：提取單克隆細胞系的全基因組，進行3-5次高通量測序獲得3-5個等位基因突變頻率，篩選等位基因突變頻率穩定的單克隆細胞系；

3)利用高通量測序對所述單克隆細胞系的全基因組進行等位基因頻率測定，獲得等位基因突變頻率；

4)根據步驟3)中獲得的等位基因突變頻率與目標等位基因突變頻率，確定對單克隆細胞系的稀釋倍數；

5)胰酶消化所述單克隆細胞系后，用流式細胞儀計數獲得單克隆細胞系的細胞濃度，以細胞數計，用相應數量的等位基因突變頻率為0的陰性細胞按照步驟4)中確定的倍數稀釋所述單克隆細胞系，獲得混合細胞；

6)提取步驟5)中所述混合細胞的全基因組，利用高通量測序對所述混合細胞的全基因組進行等位基因測定，獲得混合細胞的等位基因突變頻率；

7)將步驟6)中獲得的混合細胞的等位基因突變頻率與目標等位基因突變頻率比較，如混合細胞的等位基因突變頻率與目標等位基因突變頻率一致，則按照步驟4)中的稀釋倍數，用陰性細胞稀釋所述單克隆細胞系獲得參考品；若混合細胞的等位基因突變頻率與目標等位基因突變頻率不一致，則細化稀釋的倍數；重復步驟5)和6)，直到混合細胞的等位基因突變頻率與目標等位基因突變頻率一致，按照此時的稀釋倍數，用陰性細胞稀釋所述單克隆細胞系獲得參考品；

提取所述參考品的全基因組，將所述參考品的全基因組在2～4種不同測序平臺進行高通量測序測定等位基因突變頻率，篩選在不同測序平臺測定的等位基因突變頻率一致且穩定的參考品。

2.根據權利要求1所述腫瘤樣品測序參考品的制備方法，其特征在于，所述腫瘤細胞系包括NCI-H1650，NCI-H1975，NCI-H23，NCI-H2087，HCT-15，LS 174T，SW1417或SW48。

3.根據權利要求1所述腫瘤樣品測序參考品的制備方法，其特征在于，步驟4)中所述稀釋倍數為1.5～2.5倍。

4.根據權利要求1所述腫瘤樣品測序參考品的制備方法，其特征在于，步驟5)中所述陰性細胞為Hela細胞。

5.根據權利要求1或3所述腫瘤樣品測序參考品的制備方法，其特征在于，所述高通量測序采用達安基因的個人化操作基因組測序儀PGMTM。

6.根據權利要求1所述腫瘤樣品測序參考品的制備方法，其特征在于，所述目標等位基因突變頻率為確定腫瘤樣品測序檢測限所需等位基因突變頻率或腫瘤樣品測序的陽性質控品所需等位基因突變頻率。

7.根據權利要求6所述腫瘤樣品測序參考品的制備方法，其特征在于，所述目標等位基因突變頻率為1％、2％、5％或15％。